荧光原位杂交技术在污水处理方面的最新研究进展

前言
上个世纪60年代，分子生物学技术的出现，使得在分子级别上进行生命现象研究得到了快速的发展。一系列新技术方法的应用，将环境微生物的研究从传统方法提升到新的高度［2,3］。FISH(Fluorescence in Situ Hybridization，荧光原位杂交)法作为一项对细胞及细菌等微生物研究的有效手段，可以定性及定量的对绝大多数微生物进行实时观测研究［3，4，5，］。
1989年Delong等人为了检测出特异微生物的存在，首先对细菌的16S rRNA［6］通过原位杂交进行荧光标的，再应用荧光显微镜进行观测，从而正式确立了FISH法在生物组织微观研究中的应用。该方法于1990年首次应用到活性污泥的研究中，目前已经在环境微生物全方位的研究中得到普及。早期的研究一般采用此方法对细菌种类的确认以及时间与空间分布等的定性研究方面。最近，关于应用FISH法对观测对象进行计数的相关研究多有报道，Okabe等人于2003年曾经对旋转盘式生物膜法水处理装置中的生物膜在脱氮菌的处理机能进行研究时，应用FISH法对硝化菌进行了定量计数观测［7］，研究结果证明了定量研究的可行性。Tamatubo等人在所进行的关于石油污染的生物清除过程中对Alkanes及芳香族有机物质具有分解机能的Alcanivorax菌进行了计数观测研究，同样取得了理想的研究成果。

荧光原位杂交（FISH）简介
荧光原位杂交技术（Fluorescent in situ Hybridization）：用荧光染料或生物素标记的核酸探针在原位的条件下（在细胞内）检测、定位（通过与互补序列杂交）含有特异DNA或RNA序列的微生物细胞。［1］
荧光原位杂交技术（FISH）的实验方法
将被测样品（细胞）固定在载玻片上，用化学试剂使细胞具有通透性，并使其中的DNA变性，在杂交液中让经标记具有互补序列的核酸探针与目的DNA序列杂交，洗去多余的探针，用荧光显微镜检测样品。［1］
关键步骤如下：
1）探针的准备
A．单链、双链DNA, 单链RNA
B．放射性元素（P,S)或荧光 (地高新,生物素）标记
C．标记后的探针用消毒去离子水-20℃ 保存可达两年
2）细胞固定和通透化
A．固定：保持细胞形态结构；DNA与RNA
B．处理液：多聚甲醛/乙醇、表面活性剂、酸等
C．细菌类别不同，效果不同
3）细胞杂交
A．杂交条件：温度、pH、盐浓度等
B．杂交温度的确定：最佳的杂交温度是探针和对应靶序列碱基组成的函数：
根据碱基组成：+2℃ /G(C) , +4℃ /A(T)，杂交液浓度：4%甲酰胺Buffer
C．严格的杂交条件vs宽松的杂交条件
D．非特异性结合与背景荧光问题（合适的对照实验）：阳性（真菌探针EUB338）
阴性（与目标不同的序列做探针）
4）荧光显微镜检查
A．选择合适的滤光系统，杂交后的样品在抗退色剂中可进行显微观察：
B．荧光素灵敏度比较高，检测限比较低，但容易退色，另外如果背景荧光比较强，
检测会比较困难；
C．可以先使用相差显微镜检查、定位样品，然后换用荧光显微镜进行观察；
D．为对一系列荧光色素及密度的变化进行更加详细的定量分析，建议采用具有相应
图象分析功能的显微镜

荧光原位杂交技术（FISH）的实验方法［1］

活性污泥培养3周后的光学和FISH照片［1］
FISH的局限性及可能的解决途径
1）细胞壁的渗透性是一个重要的限制条件，而细胞能否变得具有通透性不容易预测；
2）自然环境如土壤中生长的细胞与在实验室条件下生长的细胞相比对寡核苷酸探针表现出不同的通透性；
3）无法保证探针在细胞内与rRNA杂交发生：与核糖体蛋白的强烈作用；rRNA内部高度稳定的二级结构元素所造成的目标序列的不可接近性；
4） FISH技术的灵敏度（是否能获得强烈的信号）与细胞的新陈代谢过程的关系；
5）目标种群的显微分析限在104-105。因为：即使目标细胞是活性的，但它们只代表了本土微生物的很少一部分，必须搜索大量的显微镜视野才能对目标生物进行定位；
以上这些问题可能通过利用流式细胞仪进行细胞分选或者通过在分析之前的某种形式的富集来解决；
6）多种生物序列的获得性越来越大，探针（引物）的特异性及检测探针的设计变得越来越困难；一个特异的18位探针或引物与一个不相关生物的可变区域结合的可能性是1：418；在可变区域内找到18个可变位置的可能性是非常小的，更多的情况是探针只在四五个碱基位置不相同。在一个未知不相关的生物中遇到相同序列的可能性将为1：45（对于5个碱基不同的情况）；
这个问题可以通过使用多种探针，用不同的荧光色素标记并结合到rRNA分子的不同位置，来提高FISH技术的灵敏度，但几个专门设计的寡核苷酸探针结合位点在目标微生物中同时出现的可能性非常降低。［1］

荧光原位杂交技术（FISH）新的研究
近年来，荧光原位杂交（FISH）技术作为一种应用分子生物学技术对细胞及细菌等微生物进行定性以及定量分析的研究方法，在国际上得到广泛的应用。例如，应用FISH法对污水处理工艺中细菌数量的计数方法研究［8］；应用FISH技术对猪舍废水中氮化物处理反应器的分析［9］；Improved permeabilization protocols for fluorescence in situ hybridization (FISH) of mycolic-acid-containing bacteria found in foams［10］。
东北大学机械工程与自动化学院朱彤等人应用FISH法对污水处理工艺中细菌数量的计数方法研究，以自养型硫磺脱氮菌TD(Thiobacillus Denitriicans)为研究对象，应用FISH法对实验装置中的TD菌群在给定条件下的空间与时间分布进行定性与定量的测定，以此评价排水处理实验装置的性能与工艺方法的有效性，同时对FISH 观测中污泥与生物膜试样进行有效处理方法的研讨介绍了活性污泥试样制作、FISH法观测试样的制作以及各种试剂的配制、作用以及使用方法，基因探针的选择原则、杂交方法等实际操作方法与过程。
通过应用FISH法实现了对经过培养的生物膜中的脱氮菌TD的数量观测。为达到应用细菌计数的目的，采用向含有柠檬酸的1倍PBS缓冲液中添加活性污泥或生物膜试样，再采用超声破碎方法，证明该方法是对菌胶团的均匀是相对有效的方法。?
在以往对微生物的研究中，关于微生物数量的判断大多直接测量MLSS或MLVSS浓度作为细菌浓度变化的指标，上述实验结果表明，系统中MLSS不变的条件下，不同菌种的菌体个数及活性有较大的不同。
朱彤等人认为，通过FISH法对不同菌群的种类与数量的观测，可以将有关活性污泥的研究提升到分子生物学层次，使得研究更具体深入。

参考文献：
1.王慧. 现代环境微生物监测原理与技术讲义（2007）清华大学环境科学与工程系
2.王爱杰，任南琪. 环境中的分子生物学诊断技术.北京：化学工业出版社，2004.1~14.
　　3.杜连祥，路福平等. 微生物实验技术.中国轻工业出版社,2005.
　　4.Barbara B. 王瑛等译. FISH荧光原位杂交技术.天津科技翻译出版公司,2003.1~3.
　　5.岡部　聡．微生物群集構造解析技術の現状と今後の展開?課題．水環境学会誌，2005，28(8)：460~465.
6.Delong,E.F., et al. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells, Science, (1989)243, 1360~1363.
7.Satoh H, Okabe S, Yamaguchi Y, Watanabe Y. Evaluation of the impact of bioaugmentation by in situ hybridization and microelectrode.Water Research， 2003 ，37(9)：2206~2216.
8. 朱彤，应用FISH法对污水生物处理系统中细菌数量的计数东北大学机械工程与自动化学院http://www.syepi.com/hbkx/default.asp?id=743&cmd=show
9. Yuan, Z, Kim, T. H., Kim, D. J., Keller, J. Fluorescence in situ hybridization analysis of nitrifiers in piggery wastewater treatment reactors. Water Science and Technology, 2004 (Vol. 49) (No. 5/6) 333-340
10.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=15676195&dopt=Abstract