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　　摘要：为了改变传统的将两栖类动物处死后再从肌肉提取DNA的取样方法，采用非伤害性取样方法分别采集了虎纹蛙的血液和趾提取DNA，并与从其肌肉中提取的DNA进行了比较，结果显示：使用血液和趾提取的DNA产量与肌肉样本的DNA产量相当；随后，分别对3种方法取样的样本进行了线粒体16SrRNA和核DNA的微卫星PCR分析，结果表明：3种取样方法所获得的扩增效果相当，均能满足虎纹蛙的保护遗传学研究．因此认为，用非伤害性取样技术替代传统的肌肉取样的方法在无尾两栖类的保护遗传学研究中是切实可行的。

　　关键词：非伤害性取样,无尾两栖类,保护遗传学,聚合酶链反应

　　保护遗传学与分子生态学的研究已经成为现代生物学研究的热点，作为研究基础的DNA，其质量的好坏成为影响实验结果的一个至关重要的因素．DNA的获得通常采用的取样方法有3种：伤害性取样(Destructivesampling)、非伤害性取样(Nondestructivesampling)和非损伤性取样(Non-invasivesampling)…．伤害性取样是指通过获得研究对象的新鲜肌肉、肝脏或者脾等组织提取DNA．这种取样方式对于物种的破坏极大，特别是对于珍稀濒危物种而言，它的破坏力是毁灭性的因此，许多研究者已经放弃了这种取样方法．非损伤性取样则是在不触及或不伤害野生动物本身的前提下，通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的样品进行遗传分析的一种取样方法．该方法的一个很大的特点是采样不会对动物本身产生伤害，但却很难收集到完整的DNA，目前该方法比较多地应用于大型兽类和鸟类的研究中．非伤害性取样则是通过抽取动物的血液、采集毛发或羽毛、耳、尾或趾等来用以分析无尾两栖类作为生态系统中的一个重要组成部分，在农田生态系统、水域生态系统以及森林生态系统中都起到非常重要的作用．然而，由于生境的丧失、外来种的入侵、过度的捕猎、紫外光的作用、化学物质的影响H和疾病，以及全球气候的变化，使得无尾两栖类的种群急剧减少因此，对无尾两栖类的保护迫在眉睫．目前国内对于无尾两栖类的遗传结构、线粒体序列以及遗传多样性等方面的研究仍然采用伤害性取样方法．采用非伤害性取样甚至是非损伤性取样策略在无尾两栖类的研究中势在必行．基于此，本文采用非伤害性取样方法从无尾两栖类的血液、脚趾提取DNA样本，探讨了非伤害性取样技术在无尾两栖类保护遗传学研究中的应用。

　　1材料与方法

　　1．1实验动物及其处理

　　以采自浙江金华的虎纹蛙(Hoplobatrachurugulosus)3只作为实验材料．使用注射器对每一个体的活体从心脏抽取血液，同时剪下不同的趾作为标记，然后处死，并剪下腿部肌肉作为实验的对照样本．采集到的血样使用酸性柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)以体积比5：1混合抗凝，剪下的趾用95％乙醇液浸泡，所有的样本均置于一70℃超低温冰箱保存．

　　1．2方法

　　1．2．1DNA的提取

　　根据文献[10]的方法略作改动，具体如下：血液样本：在常温下解冻含有抗凝剂的血液样本，取100IxL于离心管中，加入250txL抽提缓冲液(0．01mol／L的Tris-HC1(pH8．0)，0．mol／L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA，pH8．0)5g／L十二烷基硫酸钠)，离心(5000r／min，10rain)，去上清液，在沉淀物中加人100IxL抽提缓冲液和5L蛋白酶K溶液(pK)，37℃水浴4h．趾样本：取0．1g95％乙醇液浸泡的趾组织使用双蒸水反复冲洗掉表面的乙醇并剪碎，加入500L抽提缓冲液和5LpK，55℃水浴4h，离心(9000r／min，10min)后取上清液．肌肉样本：常温下解冻肌肉样本，取0．1g肌肉组织剪碎于离心管中，加入500IxL抽提缓冲液和5LpK，55℃水浴4h，离心(9000r／min，10rain)后取上清液．

　　在上述处理过的样本中加入等体积的饱和苯酚溶液，混匀(500r／rain，15rain)，离心(9000r／min，15min)，取上清液；之后，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)，混匀(500r／min，15min)，离心(9000r／min，15min)，取上清液并加入2．5倍体积的预冷的无水乙醇，置于一20℃冰箱沉淀DNA2h或以上；弃上清液后用70％乙醇液洗涤DNA，真空干燥，加入100LTE(0．01moVLTris—HC1，0．1mol／LEDTA)溶解DNA，于一20℃保存．

　　1．2．2DNA的检测

　　选择线粒体16SrRNA和核DNA的微卫星位点引物Hrug01进行PCR扩增反应，以检验DNA在遗传分析中的可用性．PCR反应体系为25含2mmoL／L或1．5mmo~LMgC12，0．15mmol／L三磷酸脱氧核糖核苷，0．06mmo~L引物，0．75UTaq聚合酶，模板DNA50ng，10mmoVLTrisHCI，50mmoVLKC1，双蒸水补足到25L．反应条件为：95℃预变性4min；95变性30s，55oC或50℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃再延伸10min．扩增产物在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳结果．

　　2结果

　　对所提取的DNA和PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：从血液和趾提取的DNA含量与从肌肉提取的DNA含量相当，均能获得较高的DNA产量(见图1)．此外，使用3种样本进行16SrRNA和微卫星PCR扩增均能获得明显的扩增产物，产物条带晰，产量高，能够很好地满足遗传学分析(见图2和图3)．

电泳图谱1

电泳图谱2

　　3讨论

　　3．1血液样本的提取及保存

　　本文采用活体心脏采血，能够较好地从动物体内采集到新鲜血液，采血量仅为50L．由于动物体内的血液含量约占身体质量的5％～8％，所以对于任何一只大于50g的个体，采集5OL血液不会对动物体产生较大的伤害．此外，本实验选择酸性柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)作为血液的抗凝剂，是由于经B(ACD)抗凝后的血液在DNA的提取和PCR扩增中均无明显的影响．而以肝素抗凝则会对后期的DNA提取以及PCR扩增产生一定程度的抑制作用；以EDTA抗凝则会使样本DNA出现降解．使用血液中的DNA作为模板的不足之处，在于血液的保存时间不能太长，时间过长会造成DNA的降解．在一85℃的条件下保存，保存期限不能超过3个月；在一70℃下保存，保存期限则不超过2个月．另外，为了在实验时获得较好的液体状态的血液，还应该在冻存前对经B(ACD)抗凝的血样以体积10：1加入细胞裂解液．

　　3．2趾样本的提取及保存

　　剪趾法目前在国外广泛地应用于无尾两栖类的研究中．采用剪趾法对所采集的动物个体进行标记，并将剪下的趾浸泡到乙醇液中保存，不仅可以通过趾提取DNA进行遗传分析，同时还可以将标记过的个体进行标志重捕，进而研究物种的种群生态学问题．此外，从本实验结果来看，使用趾提取的DNA是完全可以满足遗传分析需要的．使用乙醇液浸泡趾组织的优点在于：乙醇液浸泡会使蛋白质变性，从而达到防腐的目的；与此同时，动物体内的DNA酶也会丧失活性，从而能够较好地保存DNA；其次，使用乙醇液保存样本，对样本的影响比较小，保存期限比较长，完全能够满足在较长一段时间里的DNA提取和对该物种的遗传分析。

　　3．3取样方法比较

　　在无尾两栖类分子遗传学的研究中，剪趾法在国外被广泛地应用于相关研究中，而使用血液为样本提取DNA研究无尾两栖类的分子遗传学还未见报道，本文是对该方法的一次探讨和尝试．从两栖类动物的体内抽取血液能够获得高质量的DNA，但由于在取样过程中需要使用无菌注射器以及一个相对没有污染的环境，并且血样的保存时间有限，而且由于活体心脏取血技术有一定的难度，取血的过程也需要耗费一定的时间，所以在野外对无尾两栖类的大量取样中使用血液作为样本并不是一个首选的方法，但在仅取少量样本做快速分析时则是一个比较好的取样方法．使用剪趾法获得的趾样本，不仅保存方便，保存时间长，并且所需的试剂和工具相对简单，取样过程方便快捷，其DNA产量也高，能很好地满足分子遗学的分析，因而剪趾取样应该是野外采样中的首选方法．通过血液和趾DNA与肌肉DNA的比较分析，笔者认为对无尾两栖类完全可以用非伤害性取样替代原来的肌肉取样．

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