吉林农业大学学报论文范文赏析

　　幼畜胚胎体外生产与胚胎移植（Juvenileinvitroembryotransfer，JIVET）技术是集幼畜超数排卵、卵母细胞的体外成熟和体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植为一体的高新技术体系。利用JIVET技术能够获得大量卵母细胞，缩短优良母畜繁殖的世代间隔，加快品种培育的进程[1]。与传统的绵羊超数排卵和胚胎移植（MOET）方案相比，由于生产体外胚胎的卵母细胞供体母畜的年龄提前到8～12周龄，故生产后代羔羊的世代间隔缩短为6个月，同时还大大增加了后代数量，繁殖效率成倍提高。此外，JIVET技术结合性控精液进行后代生产，也能提高基因遗传率约5%，这为该技术的商业化应用提供了非常广阔的应用前景。

　　摘要：利用幼畜胚胎体外生产与胚胎移植（Juvenileinvitroembryotransfer，JIVET）技术能够获得大量卵母细胞，缩短世代间隔，加快育种进程。但幼畜卵母细胞形态及代谢与成年动物存在差异，这导致幼畜胚胎发育能力低。目前，对JIVET技术的研究主要是通过改进激素处理方案及体外培养条件来增加卵母细胞数量并增强卵母细胞发育能力。从供体羔羊的选择、激素处理和卵母细胞的发育等方面对该技术进行了分析。

　　关键词：幼畜胚胎体外生产与胚胎移植（Juvenileinvitroembryotransfer，JIVET）技术,羔羊,卵母细胞

　　JIVET技术应用的原理在于羔羊出生后的前2个月卵巢生长较快，卵巢的质量在4周龄和8周龄时分别增加了6.8倍和10.8倍，生长卵泡数量在4周龄时显著增加[2]。生长卵泡数量和卵巢的质量在8～12周龄时下降，一直持续到33周龄[2]。卵泡在4周龄时出现闭锁信号，在8～10周龄时达到最大值[3]。这些结果显示3～8周龄时卵泡生长旺盛，能搜集到大量的未闭锁卵母细胞。研究表明，羔羊对外源促性腺激素起反应，但部分羔羊对激素不敏感[3]。与成年羊相比，羔羊胚胎体外培养时以及移植到受体后的发育能力都很低[4]，这导致胚胎移植后胎儿流产和畸形率高[5]，极大地制约了JIVET技术的商业化应用。而通过选择适当的激素处理方案和体外胚胎生产体系能显著提高3～4周龄羔羊生产后代的能力[6，7]。目前研究表明，影响JIVET效率的因素主要包括供体的选择、超排方案和卵母细胞的发育能力等[8，9]。本文就羔羊JIVET技术的影响因素进行系统分析。

　　1供体羔羊的选择

　　理想的供体羔羊在激素处理后将产生大量的卵泡和高发育能力的卵母细胞。影响供体羔羊选择的因素包括遗传背景、年龄等。

　　1.1遗传背景

　　羔羊遗传背景主要包括品种、基因型和个体差异等。国内外研究结果表明，成年后排卵数高的绵羊品种性成熟前卵巢和卵泡发育滞后于成年后排卵数低的品种，且前者对激素的敏感性低于后者[10，11]。Sonjaya等[12]对刚出生的羔羊卵巢进行组织切片观察，发现法兰西（成年后排卵数低）各级卵泡数比罗姆尼（成年后排卵数高）多，且前者各级卵泡直径大于后者。4周龄时，法兰西3级卵泡数量多于罗姆尼，且前者直径大于后者。外源激素分别处理4周龄羔羊，能够诱导法兰西羔羊排卵，而罗姆尼不反应。白佳桦[10]用相同激素处理方法处理几个品种的羔羊，平均每只羔羊采集到的卵母细胞数排卵数高的品种显著低于排卵数低的品种。多胎基因FecB能够影响羔羊卵泡发育，3月龄不携带FecB基因的布鲁拉羊（Booroola）比携带FecB基因的布鲁拉羊拥有更多的大卵泡[11]。Ptak等[13]发现一只羔羊卵母细胞具有很高的发育能力，其生产的5只同胞羔羊的卵母细胞同样具有很高的发育能力，这说明基因型一致的羔羊卵母细胞发育能力也趋于一致。

　　1.2供体年龄

　　不同年龄段羔羊激素处理后卵巢反应不同。Armstrong[14]认为激素处理羔羊的最佳年龄为4～6周龄，因为此时大部分卵泡处于应答状态。O’Brien等[15]指出，3～6周龄羔羊卵母细胞超排效果好于16～24周龄羔羊。Morton等[6]用激素处理不同年龄（3～4周龄和6～7周龄）羔羊，发现羔羊年龄影响到子宫质量，但对卵巢质量、卵泡数量和获得的卵母细胞数量没有影响。然而，6～7周龄羔羊卵母细胞囊胚率（27.9%）高于3～4周龄羔羊（20.4%），证明羔羊随着年龄的增长其卵母细胞发育能力增强。尽管如此，年轻的羔羊（4～6周龄）激素处理效果和最终获得的后代数显著高于年长的羔羊。

　　2激素诱导应答

　　幼畜对激素的应答个体差异很大[5，13]。Ptak等[13]发现50%～72%的2～7月龄羔羊对激素反应（卵泡数量和大小）不明显。相反，Morton等[6]发现所有3～4周龄羔羊卵巢对激素应答，其中24%应答弱，44%应答中等，32%应答强；对6～7周龄羔羊的试验结果也相差不大。Ptak等[5，13]发现对激素应答弱的羔羊卵母细胞体外培养后不能发育至囊胚。相反，Morton等[6]发现3～4周龄和6～7周龄羔羊卵巢激素应答弱的卵母细胞具有发育到囊胚的能力。然而，激素应答弱和应答中等的羔羊卵巢其可用卵母细胞百分比无显著差异，但高于激素应答强的羔羊。3～4周龄羔羊不同激素应答强度的卵母细胞卵裂率和囊胚率无显著差异；但6～7周龄羔羊激素应答强的卵母细胞卵裂率低[6]。激素处理方案的改变使更多的羔羊对激素应答，提高了JIVET效率。选择适当的激素处理方法能使大部分羔羊应答明显。

　　3激素处理方法

　　激素处理羔羊能增加卵巢中可用卵泡数量，并获得大量卵母细胞[6，15]。激素处理后羔羊卵母细胞发育速度加快[6，15]。幼畜卵巢对激素应答及卵母细胞发育能力增强的确切机制还不清楚。激素应答过程伴随着卵泡变大及卵母细胞生物合成反应的进行[14]，为卵母细胞受精后的发育做准备。激素处理后，羔羊卵泡细胞内化学物质和卵泡内环境发生改变[15]。例如，诱导颗粒细胞内促性腺激素受体的形成，促使卵泡对促性腺激素反应能力增强，从而提高卵母细胞质量和功能。羔羊超数排卵的激素用法一般参照成年羊超排方案，即促性腺激素法或孕酮结合促性腺激素法。3.1促性腺激素法

　　单次或多次注射促卵泡成熟激素（FSH）不能影响每只羔羊采集的卵母细胞数量[5，16]。然而，多次FSH处理能提高卵母细胞发育到囊胚的能力[5，17]。羔羊超数排卵的激素用量低于成年绵羊，因为羔羊体重低于成年羊且羔羊卵泡对激素非常敏感[2]。但相比成年动物，低剂量促性腺激素造成激素与卵母细胞结合的量减少，这就造成卵母细胞体外成熟时发育能力减弱。研究表明大剂量促性腺激素能提高幼畜卵母细胞细胞质成熟能力。目前，羔羊JIVET的最佳FSH剂量为130～160mg[6，17，18]。马绒毛膜促性腺激素（eCG）不能增加羔羊超数排卵后采集的卵母细胞数量，但能提高其囊胚率[17，18]。目前报道的能显著提高卵母细胞囊胚率的超排方法是每隔12h注射1次FSH（40mg/次），连续注射4次，最后1次注射FSH时同时注射500IUeCG，在第一次注射FSH后48h采集卵母细胞[17]。

　　3.2孕酮+促性腺激素法

　　促性腺激素和孕酮一起使用能增加幼畜超排的卵母细胞数量和体外发育能力[6，15]。孕酮处理7d后停药，卵巢上可见卵泡比未用药前多了2倍[16]。然而，停药后卵母细胞处于不同的成熟期，说明孕激素处理虽然增加了卵泡的数量，但降低了卵母细胞质量。且孕激素处理后再注射FSH与仅注射FSH相比没有影响采集到卵母细胞数量。

　　4幼畜卵母细胞形态和代谢特点

　　研究表明，幼年动物和成年动物卵母细胞的细胞器在形态上存在明显不同。比如，同期幼年动物卵母细胞比成年动物卵母细胞的直径小，但GV期时其胞质细胞器（如线粒体、高尔基体、内质网和脂滴）形态和成年动物相似[19]。而幼年动物放射冠细胞触角比成年动物少，体外成熟时皮质颗粒迁移延迟[16]。

　　卵母细胞成熟时蛋白质的合成依靠卵母细胞和卵丘细胞相互作用，这是卵母细胞减数分裂及胚胎正常发育的前提[20]。体外成熟过程中卵母细胞摄入的氨基酸[21-23]及合成的蛋白质[23]很少，幼年动物卵母细胞蛋白质合成峰值出现的时间与成年动物不同[23]，这是因为卵丘-卵母细胞间相互作用存在缺陷[21，22]。此外，幼年动物卵母细胞内成熟促进因子（MPF）合成水平和构象与成年动物相似，但成熟后幼年动物卵母细胞MPF活性低于成年动物[22]。

　　幼年动物卵母细胞代谢也不同于成年动物。体外成熟过程中幼年动物卵母细胞谷氨酰胺代谢水平低于成年动物，葡萄糖和丙酮酸代谢水平和成年动物相似。以上结果表明幼年动物卵母细胞形态、代谢和超微结构与成年动物有所不同，但这些研究所用的羔羊年龄范围大（40d至6个月），且所用的激素处理方案不同，这些可能影响到试验结果。

　　5幼年动物卵母细胞的体外发育潜力

　　与成年动物卵母细胞相比，幼年动物卵母细胞成熟时减数分裂速率相差不大[22]，且幼年动物卵母细胞体外生产的囊胚在形态上无差别，其总细胞数[23，24]及内细胞团细胞数与总细胞数比率[23，24]差异不显著，但其异常受精率高[22，23]且囊胚率低[13，17]。目前一般将这种情况归结于细胞质成熟的紊乱。细胞质成熟紊乱会造成受精异常，不能形成正常的雄原核，不能阻止多精入卵，阻止受精卵继续发育。最终造成胚胎基因组表达异常，预附植时胚胎丢失，附植后胚胎发育失败[14]。不仅胚胎成活率低，胎儿丢失率[5，13，15]和木乃伊化比率[5]也高。Ptak等[25]报道称妊娠中断发生在妊娠第40～60天，胎儿丢失发生在妊娠第80～100天，仅仅6%胚胎能发育并完成整个妊娠期。

　　6小结与展望

　　限制JIVET技术商业化的因素包括幼畜对激素的反应不稳定、卵母细胞发育能力低等。但通过使用高剂量FSH能诱导所有羔羊卵巢发育[6]。品种和基因型也会影响幼畜超数排卵效果[17，18]。目前，有学者研究的羔羊卵母细胞发育能力和成年羊没有区别，且移植后妊娠率高[17，18，26]。所以通过选育特定基因型通过JIVET技术育种或许是一个不错的选择。

　　基因组学能让我们更深入地研究成年动物和幼年动物的区别。目前已发现幼畜胚胎内几种重要的发育相关基因的表达与成年动物不同[27，28]。Ptak等[25]发现羔羊胚胎移植后胎儿发育停滞是由于全基因组甲基化水平低造成的。这些基因表达水平上的研究将使我们更深入地了解幼年动物和成年动物卵母细胞和胚胎的差异，为进一步改进幼畜胚胎体外生产技术提供理论支持。

　　目前，幼畜胚胎体外生产技术已经取得了很大的进步，Kelly等[18]进行羔羊胚胎体外生产并移植，平均每只供体羔羊能生产16只羔羊后代。而随着幼畜胚胎体外生产效率的不断提高，该技术也将为优良家畜繁育及新品种培育等领域提供更加广阔的应用前景。

　　参考文献：

　　[1]GRAZYNAP，MARIANT，NICOLAB，etal.Donor-dependentdevelopmentalcompetenceofoocytesfromlambssubjectedtorepeatedhormonalstimulation[J].BiolReprod，2003，69（1）：278-285.

　　[2]KENNEDYJP，WORTHINGTONCA，COLEER.Thepost-nataldevelopmentoftheovaryanduterusintheMerinolamb[J].JReprodFertil，1974，36（2）：275-282.

　　[3]TASSELLR，CHAMLEYWA，KENNEDYJP.Gonadotrophinlevelsandovariandevelopmentintheneonatalewelamb[J].AustJBiolSci，1978，31（3）：267-273.[4]MCMILLANWH，MCDONALDMF.Survivaloffertilizedovafromewelambsandadultewesintheuteriofewelambs[J].AnimReprodSci，1985，8（3）：235-240.

　　[5]PTAKG，LOIP，DATTENAM，etal.Offspringfromone-month-oldlambs：Studiesonthedevelopmentalcapabilityofprepubertaloocytes[J].BiolReprod，1999，61（6）：1568-1574.

　　[6]MORTONKM，CATTSL，MAXWELLWMC，etal.Effectsoflambage，hormonestimulationandresponsetohormonestimulationontheyieldandinvitrodevelopmentalcompetenceofprepubertallamboocytes[J].ReprodFertilDev，2005，17（6）：593-601.

　　[7]郭洪，万鹏程，石文艳，等.EGF和β-巯基乙醇对羔羊卵母细胞体外受精和体外发育的影响[J].安徽农业科学，2012，40（11）：6537-6540.

　　[8]MENCHACAA，VILARINOM，CRISPOM，etal.Newapproachestosuperovulationandembryotransferinsmallruminants[J].ReprodFertilDevelop，2010，22（1）：113-118.

　　[9]陈晓勇，田树军，桑润滋，等.诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产[J].农业生物技术学报，2008，16（3）：456-460.

　　[10]白佳桦.性成熟前绵羊、牛JIVET技术的研究[D].北京：中国农业大学，2008.

　　[11]MCNATTYKP，LUNS，HEATHDA，etal.OvarianfollicularactivityinBooroolalambswithandwithoutafecunditygene[J].JReprodFert，1987，79（1）：57-66.

　　[12]SONJAYAH，DRIANCOURTMA.OvarianfolliclesduringinfancyinRomanovandIle-de-Franceewelambs[J].JReprodFert，1987，81（1）：241-248.

　　[13]PTAKG，TISCHNERM，BERNABON，etal.Donor-dependantdevelopmentalcompetenceofoocytesfromlambssubjectedtorepeatedhormonalstimulation[J].BiolReprod，2003，69（1）：278-285.

　　[14]ARMSTRONGDT.Effectsofmaternalageonoocytedevelopmentalcompetence[J].Theriogenology，2001，55（6）：1303-1322.

　　[15]O’BRIENJK，BECKNF，MAXWELLWM，etal.Effectofhormonepre-treatmentofprepubertalsheepontheproductionanddevelopmentalcapacityofoocytesinvitroandinvivo[J].ReprodFertilDev，1997，9（6）：625-631.