中学化学教学参考教师论文范文

　　近年来，微流体技术（Microfluidicstechnology）快速发展[1，2]，已在化学、医药及生命科学等领域引起广泛关注。微流体芯片，又称为“芯片实验室”（Lab-on-a-chip）[3]，利用微机电技术将一般实验室所使用的分离、反应、混合等装置微小化到芯片上，以进行生化反应、分析，可以对微量流体进行复杂、精确的操作，因其具有体积轻巧、使用样品和试剂量少、反应速度快、平行处理大量样品等优点[4～6]，在生物分析技术领域广泛应用[7～9]。

　　摘要：将磁敏传感器与微流体测试卡集成，研制了可快速检测多靶标生物标志物的微流体免疫磁敏传感器。以3种消化系统肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、糖链抗原）为模型靶标，对免疫反应各步反应的液体流速、免疫反应时间以及反应后的冲洗速度进行了优化，评价了多靶标同时检测的系统性能。在微流体磁敏生物传感器系统中，建立了血清样本中3种靶标同时检测的标准工作曲线，AFP、CEA和CA19-9的检出限分别达到0.1μg/L、0.1μg/L和30U/mL，线性范围跨越4个数量级。微流体磁敏生物传感器可在30min内完成多靶标生物标志物检测，临床血清样本的测试结果与ELISA法一致，具有检测时间短、灵敏度高的优点。

　　关键词：微流体,磁敏传感器,多靶标生物标志物

　　1引言

　　生物传感器技术[10～12]作为生物分析技术中的一个重要分支，结合了生命科学、分析化学、物理学、计算机信息科学等相关技术，能够对待检物质进行快速分析，在医疗检测、环境监测、食品安全、军事安全等领域有广泛的应用。其中，磁隧道结（Magnetictunneljunction，MTJ）传感器[10～16]是一种利用巨磁阻效应的新型生物传感器，以超顺磁颗粒为检测探针，具有体积小、成本低、生物背景低、灵敏度高、高通量等特点，有望为生物学[10～14]、药学研究[15]、医学检验[16]等领域提供便携、快捷的新技术平台。

　　肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生或由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在种生长的一类物质。多种肿瘤标志物的联合检测能够提高诊断的准确性，上广泛应用于不同类型肿瘤的早期发现和诊疗[17～20]。目前的肿瘤标志物检测方法主要有酶联免疫分析法（ELISA）、放射免疫分析法、荧光免疫分析法和胶体金试纸条检测等，这些方法多是针对单个标志物的单靶标测试，且耗时长，操作较复杂。结合微流体技术检测体系，可以提高自动化程度；磁敏传感器检测技术，可以进行高灵敏度、高通量、多靶标的快速测试，可以为肿瘤标志物的联合检测提供高效的检测方法。

　　本研究以磁敏传感器为平台，设计并建立研制了一种芯片上的微流体磁敏生物传感器，评价了基于磁敏传感器的消化系统肿瘤标志物多靶标定量检测的可行性。

　　2实验部分

　　2.1仪器与试剂

　　磁敏传感器检测仪样机及配套磁敏传感器测试卡（40mm×50mm）由东莞博识生物科技有限公司与中国科学院理化技术研究所联合研制；MTJ传感器阵列（6.6mm×10.7mm×0.75mm，MagicTechnologies，US）；DZF-6020型真空干燥箱；L0107-1A注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）；BX51荧光显微镜（Olympus公司）；EASYpureLF超纯水系统（美国Barnstead公司）。

　　甲胎蛋白（AFP）抗原标准品、癌胚抗原（CEA）标准品、糖链抗原（CA19-9）标准品、抗AFP包被抗体、抗CEA包被抗体、抗CA19-9包被抗体、Biotin标记抗AFP抗体、Biotin标记抗CEA抗体、Biotin标记抗CA19-9抗体（美国FitzgeraldIndustriesInternational公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京欣经科生物技术公司）；优级纯胎牛血清（北京欣经科生物技术公司）；亲和素-超顺磁颗粒（Avidin-beads，法国Ademtech公司）；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTS，97%，美国AlfaAesar公司）；Na2HPO4，KH2PO4，Na2CO3和NaHCO3（美国Merck公司）；实验用水均为超纯水。

　　2.2磁敏传感器免疫测试原理

　　磁敏传感器是以超顺磁颗粒作为探针，通过MTJ传感器阵列芯片对生物分子捕捉到的超顺磁颗粒的响应，实现对芯片表面的生物分子进行分析检测。在外加磁场作用下，超顺磁颗粒被磁化、产生磁场（图1），磁颗粒产生的磁场干扰下方的MTJ传感器，使其产生电阻率变化、进面转化为电流信号变化，即得到磁颗粒数目的信号[16]。肿瘤标志物的检测是使用夹心免疫反应原理，芯片表面的第一抗体（1stAntibody）、血样中的抗原（Antigen）与生物素修饰的第二抗体（2ndAntibody-Biotin）通过特异的免疫反应，形成夹心结构；超顺磁颗粒（Avidin-Bead）上的亲和素与第二抗体的生物素结合，从而被捕获到芯片表面；当施加微弱磁场时，MTJ传感器感应到磁颗粒，产生电流信号，信号大小可以反映出样品中的抗原浓度，以达到定量检测样品中靶标分子的目的。

　　2.3微流体磁敏生物传感器测试卡的设计

　　将修饰了特定抗体的磁敏传感器集成到微流体测试卡内，实现程序化进样、反应、分离和测试。如图2A所示，整个测试卡是由样品舟（Cartridge）、微通道层（PDMSlayer）和芯片印制电路板（PrintedcircuitboardwithMTJchip，PCBwithMTJchip）三层结构构成。样品舟上共有4个液体注入口，分别为待检测样品（Sample）、清洗液（Rinsingbuffer）、生物素修饰的第二抗体（2ndAntibody-biotin）和亲和素-磁颗粒（Avidin-beads）。在PDMS层上设计有液体流动的微通道，进样口内的液体在微量注射泵的驱动下，依次从不同的进样口流经芯片的点样区进入废液池，图2B展示的是测试卡中微流体通道的平面图。在芯片上不同区域包被不同抗体，可以达到多靶标同时测试的目的。[TS（][HT5”SS]图2MTJ生物传感器的测试卡设计简图（A）和微流体通道示意图（B）

　　Fig.2DesignsketchofMTJbiosensortestcard（A）andfluidicchannel（B）[HT5][TS）]

　　2.4实验步骤

　　2.4.1缓冲溶液及稀释液的配制磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）：以KH2PO4和Na2HPO4配制，并用H3PO4和NaOH溶液调节至pH7.4。包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）。0.1%BSA-PBST溶液为清洗液、Antibody-Biotin及Avidin-Beads的稀释液，1%BSA-PBST作为封闭液。标准溶液的配制：取适量抗原标准品，用胎牛血清稀释至特定浓度使用。以上所有溶液均加入0.04%NaN3，于4℃保存。

　　2.4.2免疫分析过程全部反应过程在室温下进行。在3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷处理的芯片表面，用pH9.6的碳酸盐缓冲液制备的浓度为20mg/L的AFP，CEA，CA19-9抗体包被溶液及BSA溶液，分别取500nL滴加在芯片测试区域[21]，在湿度为90%的环境中温育10min；加入1%BSA-PBST封闭液，5min后将芯片装入测试卡，向测试卡中注入40μL待测样品，室温下样品中抗原与固定抗体反应一定时间后，用清洗液冲洗，除去游离的抗原；再注入40μL混合标记抗体-生物素，室温下反应一定时间后，注入80μL清洗液；然后注入40μL亲和素-磁颗粒，反应一定时间；最后注入80μL清洗液冲洗，去除未反应的磁颗粒；将测试卡载入传感器中读出磁颗粒数目，并计算出磁颗粒数目与样品中抗原含量的相关性。

　　3结果与讨论

　　3.1分析条件的优化

　　微流体系统中免疫反应的效率受到微通道的液体流速、芯片上的表面张力等因素的影响很大。实验中通过注射泵在微流体通道中依次注入反应液和清洗液，从而实现微流体中的免疫反应和冲洗过程。分析条件的优化，主要是筛选反应试剂的注入速度、免疫反应时间以及芯片表面的冲洗条件。由于储液室的体积固定，因此对注入速度和冲洗速度的筛选也就是对试剂注入时间和清洗液注入时间的筛选。对3种肿瘤标志物分别进行了筛选，这里仅列出CEA分析条件的筛选过程。

　　设定缓和的微流体条件和较充分的反应时间（每步15min），筛选出最佳标记抗体和磁颗粒溶液的浓度分别为20μg/mL和1mg/mL（10倍稀释）。在设定清洗液体积为80μL的条件下，改变清洗液注入时间，研究冲洗速度对特异反应（抗原为1μg/L）和非特异吸附（抗原为0）的影响。如图3A所示，非特异吸附的磁颗粒数目随冲洗时间的缩短而略有降低，特异反应的磁颗粒数目随冲洗时间的缩短而降低，为了获得最高的信噪比，最优的冲洗条件为在60s内注入80μL清洗液。

　　芯片表面的免疫反应如图1所示，血样中的抗原与芯片上的包被抗体的结合，直接影响最终的免疫夹心结构的形成，因此抗原溶液的静置时间，对肿瘤标志物的免疫分析有直接而重要的影响。实验中筛选了含有CEA抗原的血样的静置反应时间（图3B），在1μg/L抗原浓度下，随静置反应时间延长，反应区检测到的磁颗粒数目增加，10min后增加幅度变小，基本达到平衡。对标记抗体和磁颗粒溶液的静态反应时间进行了筛选，由于二者的使用浓度较高，所以反应在5min左右基本达到饱和。由此确定了肿瘤标志物免疫分析中三步免疫反应的时间分别为10，5和5min。[TS（][HT5”SS]图3冲洗时间和样品静态反应时间的筛选

　　Fig.3Optimizationoftherinsingtime（A）andstaticreactiontime（B）forcarcino-embryonicantigen（CEA）[HT5][TS）]

　　在微流体传感器体系中分别筛选了AFP，CEA和CA19-9的测试条件，3种肿瘤标志物的最佳反应时间相近，最佳冲洗条件略有差别（表1），故多靶标联合检测中选择60s作为最佳冲洗时间，使用微流体磁敏生物传感器，可以在30min内同时进行3种肿瘤标志物的检测。