作物生产论文两种茶树花粉的生活力

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发布时间：2014-04-10 09:43:25 更新时间：2014-04-10 09:09:24

　　茶树[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze]是多年生异花授粉的木本植物，因其叶含有多种对人体有益的功能成分，而被作为一种经济作物广泛栽培。生产上茶树多采用无性繁殖以保持其优良性状，却易导致品种退化和病虫害抗性降低[1]。杂交育种是培育茶树新品种的重要途径之一。

　　摘要：为开展茶树[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze]杂交育种工作，以茶树品种台茶12号（C.sinensis‘Taicha12’）和福鼎大白茶（C.sinensis‘Fuding-dabaicha’）为试材，采用离体培养法开展花粉生活力与贮藏力研究。结果表明，H3BO3、蔗糖、pH、琼脂浓度以及萌发温度对供试的两种茶树花粉离体发芽率均有明显影响。两种茶树花粉离体萌发的最适培养基成分均为300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3+100mg/LH3BO3+10%蔗糖+1.0%琼脂，最适pH5.4，适宜萌发温度为16～21℃。贮藏温度对茶树花粉生活力保持具有显著影响，温度越低越有利于花粉活力的保持。-70℃最适于茶树花粉的长期贮藏，贮藏180d后，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为71.12%、50.61%。在生产实践中，-20℃贮藏茶树花粉亦可取得较好的效果，贮藏180d后，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为60.16%、46.88%。

　　关键词：台茶12号,福鼎大白茶,花粉,离体萌发,生活力,贮藏力

　　但茶树为异花授粉的虫媒花植物，且开花期间气温低、昆虫活动少，导致茶树天然结实率较低[2]。在育种实践中，往往由于茶树亲本的花期不遇给杂交育种工作造成很大困难。茶树花粉的生活力与贮藏力研究为解决这些问题提供了一条思路，对茶树杂交育种以及种质资源保存具有一定的理论与实践意义[3，4]。目前，关于茶树花粉生活力和贮藏力的研究报道较少[4-8]。鉴于此，以华中农业大学校内种植的两个茶树品种为试材，开展花粉生活力与贮藏力研究，以期为茶树杂交育种与优良种质保存提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　以华中农业大学茶园引种栽培的的两个品种为试材。台茶12号（C.sinensis‘Taicha12’）：由台湾省茶叶改良场选育，无性系，灌木型，中叶类，中生种[1，2]。福鼎大白茶（C.sinensis‘Fuding-dabaicha’）：由福建省福鼎市点头镇柏柳村选育，无性系，小乔木型，中叶类，早生种[1，2]。

　　1.2方法

　　1.2.1花粉采集及贮藏于2010年12月盛花期间天气晴好的上午，采集生长良好的福鼎大白茶、台茶12号的大蕾期花朵。摊放于白纸上，并置于阴凉通风干燥处放置24h使花蕾开放、花药开裂。用毛笔轻轻刷下花粉，并置于阴凉通风干燥处，至抖动花粉不结块时收集。取少许新鲜花粉用于筛选适宜萌发的培养基以及检测花粉生活力试验。剩余花粉分别装入离心管中，以脱脂棉封口，置于干燥器中，花粉体积不超过离心管体积的1/3。将干燥器分别置于室温（RT）、4、-20、-70℃下避光贮藏。

　　1.2.2花粉生活力检测采用人工离体萌发法检测花粉生活力，具体试验方法及步骤如下。

　　1）花粉的吸水处理。播种前，取新鲜花粉于4℃、暗环境、饱和空气湿度条件下放置2h，以充分吸水[9]。

　　2）培养基中各因素对花粉离体萌发的影响。茶树喜酸性土壤，以台茶12号为试材，分别设置琼脂浓度、pH、蔗糖、H3BO3四因素各三个水平，进行正交试验（表1），以初步确定各因素对花粉离体萌发的影响。播种时，用解剖针将充分吸水的花粉均匀播种于培养基，并将培养基置于铺有湿润滤纸的培养皿中，盖上培养皿，于25℃暗培养24h后观察花粉萌发情况[10]。每个培养皿于10×10显微镜下观察，每个视野不少于50粒花粉，记录每个视野的发芽率（萌发花粉数/花粉总数），以花粉管长度大于花粉直径时记为萌发。取6个视野的平均值作为该培养基的花粉发芽率，初步确定花粉离体培养时各因素适宜的水平。

　　3）两种花粉最适离体萌发培养基的筛选。为了筛选两种花粉最适离体萌发培养基，在上述试验的基础上，设置10种固体培养基，pH5.4，基本成分为1.0%琼脂+300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3，设置3种添加量的蔗糖（5%、10%、15%）和3种浓度的H3BO3（50、100、200mg/L）进行完全组合，以不添加蔗糖和H3BO3的基本培养基为对照（表2）。

　　4）萌发温度对花粉离体萌发的影响。茶树于冬季低温期开花。以台茶12号新鲜花粉为试材，对萌发温度、培养基琼脂含量与pH对花粉离体萌发的影响进行了研究。将花粉吸水后播种于最适培养基上，分别置于4℃、室温（16～21℃）、28℃、37℃下进行暗培养，培养8、24h后进行花粉生活力测定。

　　1.2.3贮藏期间花粉生活力的测定以福鼎大白茶和台茶12号花粉为试材，取出4种温度下贮藏0、7、15、30、60、120、180d的花粉，置于4℃下吸水2h后播种于上述试验筛选的最适离体萌发培养基，进行生活力测定，以此确定两种供试花粉的贮藏力。

　　1.2.4数据分析方差分析、多重比较采用SAS8.1统计软件分析。所有百分数都进行反正弦转换后再用于数据分析。

　　2结果与分析

　　2.1培养条件对茶树花粉离体萌发的影响2.1.1培养基各因素对台茶12号花粉离体萌发的影响从表1和表2可以看出，琼脂、pH、蔗糖、H3BO34个因素均对台茶12号花粉的萌发产生了明显的影响，各因素对茶树花粉离体发芽率的影响从大到小为pH、H3BO3、琼脂、蔗糖。pH的影响最为明显，因此，合适的pH对花粉离体培养成功与否至关重要。1.0%的琼脂更有利于花粉的离体萌发。随着H3BO3和蔗糖添加量的增多，花粉发芽率总体呈现先升高后降低的趋势，说明低于和高于最适宜的H3BO3和蔗糖浓度均会对花粉萌发产生一定的抑制作用。根据以上结果，筛选出最适宜台茶12号萌发的培养基组合为：1.0%琼脂+10%蔗糖+100mg/LH3BO3+300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3，pH5.4。

　　2.1.2最适离体培养基的筛选由表2可以看出，H3BO3、蔗糖及其交互作用对两种茶树花粉的发芽率均有明显影响。添加蔗糖和H3BO3后，两种花粉的发芽率均明显高于对照。当蔗糖添加量一定时，花粉发芽率随H3BO3浓度增加呈不同的变化趋势；当H3BO3浓度一定时，花粉发芽率也随蔗糖添加量的增加呈不同的变化趋势。可见，适宜浓度的蔗糖、H3BO3对供试茶树花粉离体萌发有明显的促进作用。在培养基S2B2上，福鼎大白茶和台茶12号的花粉发芽率均达到了最大值，分别为54.09%和64.02%，明显高于其他培养基上的发芽率。可见，培养基S2B2适合茶树花粉离体萌发。此外，对各种培养基上福鼎大白茶与台茶12号的花粉发芽率进行比较，两种茶树花粉发芽率差异明显，说明茶树花粉发芽率存在种间差异。

　　综上所述，供试培养基中，最适宜的福鼎大白茶和台茶12号花粉离体萌发的培养基组成均为：基本成分+10%蔗糖+100mg/LH3BO3，这与正交试验结果一致，说明正交试验结果较为可靠。

　　2.1.3培养温度对茶树花粉萌发的影响从表3可以看出，台茶12号花粉在4～37℃均可萌发。花粉培养8h后，4℃、室温（16～21℃）、28℃、37℃下的花粉发芽率差异显著。其中室温条件下花粉发芽率最高，为37.56%，其次为28℃和4℃，37℃条件下花粉发芽率最低，为11.70%。

　　随着培养时间的延长，各温度条件下的花粉发芽率均有所增加。其中，37℃下花粉发芽率始终最小，培养24h发芽率为14.03%，说明高温不适宜茶树花粉的离体萌发。4℃下的花粉发芽率增长最快，培养24h后发芽率已超过室温和28℃，增至最大，达到45.46%。多重比较结果显示，培养24h时4℃与室温、28℃下的花粉发芽率差异显著。由此可见，4～21℃下茶树花粉都可以充分萌发，但以低温下萌发情况较好，可能跟台茶12号于冬季低温期开花、授粉的习性具有一定的关系。

　　2.2贮藏时间和温度对茶树花粉生活力的影响

　　2.2.1贮藏时间对花粉发芽率的影响随着贮藏时间的延长，各贮藏温度下福鼎大白茶、台茶12号花粉的生活力总体呈逐渐降低的趋势，即贮藏时间越长花粉发芽率越低。对福鼎大白茶而言，整个贮藏期内，不同温度下贮藏花粉的发芽率呈现很大的差异，但是在贮藏前60d内，仅有小幅度降低，仍均保持在40%以上。多重比较结果表明，此时不同温度之间的发芽率无显著差异。但是在随后的贮藏时间里，各贮藏温度之间的发芽率开始呈现显著差异。其中室温下发芽率急剧降低，至180d时，花粉已完全失活；4℃下贮藏60d后也开始大幅度下降，至180d时发芽率仅有20.45%；而在-20℃和-70℃下，在整个贮藏期间花粉发芽率仅有小幅度下降，至180d时发芽率仍分别有46.88%和50.61%（图1）。

　　对于台茶12号而言，不同温度下贮藏花粉的发芽率降幅亦呈现很大的差异，但是在贮藏前30d内降幅均较小，发芽率仍均保持在60%以上。多重比较结果显示，此时不同温度之间的发芽率无显著差异。但是在随后的贮藏期间，各贮藏温度之间的发芽率开始呈现显著差异。其中室温下贮藏30d后花粉发芽率开始大幅下降，至180d时花粉已完全失活；4℃下贮藏120d后开始大幅度下降，至180d时发芽率仅有18.79%；而在-20℃和-70℃下，在整个贮藏期间花粉发芽率仅有小幅度下降，至180d时发芽率仍分别有60.16%和71.12%（图2）。

　　综上所述，随着贮藏时间的延长，福鼎大白茶和台茶12号花粉活力均呈现下降的趋势。但是通过采取降低贮藏温度的措施可有效延长花粉贮藏期，保持花粉活力在较高水平，同时也说明两种供试花粉有长期贮藏的潜能。

　　2.2.2贮藏温度对花粉发芽率的影响从图1和图2可以看出，在相同的贮藏期内，贮藏温度越低越有利于茶树花粉活力的保持；贮藏时期越长，贮藏温度越低越有利于花粉活力的保持。对于福鼎大白茶，短期贮藏（60d以内）时，4种贮藏温度之间的发芽率差异不显著，因此可采用4℃或者-20℃进行花粉贮藏，简便易行。在长期贮藏中（180d）-20℃和-70℃效果最好，二者之间发芽率差异不显著，因此亦可采用-20℃进行贮藏，以节约成本。对于台茶12号，短期贮藏（30d内）各贮藏温度之间的发芽率差异不显著，于室温、4℃和-20℃下贮藏均可；贮藏120d内，4℃、-20℃和-70℃之间差异不显著，因此，采用4℃和-20℃下贮藏即可；贮藏180d时，以-70℃贮藏的效果最好，且-20℃和-70℃之间差异不显著，因此采用-20℃下贮藏亦可较大程度保持花粉的活力。

　　2.2.3不同贮藏温度下花粉颜色的变化贮藏期间两种供试花粉的颜色均呈现由金黄色、明亮→黄色、明亮→淡黄色→灰白色不同程度的变化（图3）。其中，金黄色、明亮的茶树花粉发芽率高，活力强，随着颜色变暗，其活力也逐渐降低。当颜色呈灰白色、光泽偏暗时，生活力即丧失。同一品种花粉在不同温度条件下贮藏180d后颜色变化差异较大，贮藏温度越低，颜色保持得越鲜亮，花粉发芽率越高；而贮藏温度越高，颜色逐渐呈现灰白色，无光泽，花粉发芽率越低，甚至丧失活力。说明茶树花粉颜色变化与其活力变化具有一定的相关性。因此，在生产实践中，可根据贮藏花粉的色泽来初步判断花粉活力的有无，大大简化了花粉活力检测手段，提高了工作效率。3小结与讨论

　　花粉是种子植物的雄配子体，在有性繁殖中发挥着重要作用。而对新鲜花粉和贮存期间的花粉生活力进行检测，则可以掌握花粉的形态及生理特征，评估花粉是否有受精能力等[11]。目前，可用于检测新鲜花粉及贮藏期间花粉生活力的方法有多种[12]，其中花粉离体萌发法因简便快捷，直观可靠，花粉发芽率被认为是评估花粉活力的最佳指标[13]，因此，花粉离体萌发法不仅成为最常用的花粉生活力检测手段，也是分析有性繁殖基本问题的主要思路[14]。

　　3.1影响茶树花粉生活力的因素

　　在离体培养的各因素中，H3BO3及蔗糖的浓度对花粉离体萌发影响较大[15]，适量的蔗糖和H3BO3有利于花粉的萌发[10，16]。试验中不同蔗糖、H3BO3添加量对茶树花粉萌发有明显的影响，且H3BO3与蔗糖之间存在明显的交互作用。两种茶树花粉萌发的最佳蔗糖、H3BO3添加量均为10%、100mg/L；适量的蔗糖与H3BO3明显促进了茶树花粉的萌发。

　　其次，培养温度、pH、琼脂含量都对花粉离体萌发具有一定的影响。极端培养环境如高温和高湿胁迫，不仅使花粉萌发受到抑制，而且花粉形态也有可能发生改变[13，17]。本研究中，4℃和室温（16～21℃）下较适宜茶树花粉的离体萌发，花粉形态和花粉管生长均正常。而在37℃下，花粉呈褐色，部分花粉干瘪开裂。此外，在28℃和37℃下培养的茶树花粉，其花粉管长度明显短于其他温度下的，说明高温不利于茶树花粉管伸长，这可能与茶树盛花期间气温低、日温差大等环境因素具有一定的相关性。

　　3.2花粉离体萌发的通用培养基

　　试验筛选的最适培养基组合（1.0%琼脂+300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3+10%蔗糖+100mg/LH3BO3）与Brewbaker等[18]报道的适合39科79属86种植物花粉萌发的培养基组合基本一致。说明该培养基适合于多数植物的花粉生活力检测，可作为植物花粉离体萌发的通用培养基。在对某种植物首次进行花粉生活力测定时，可先采用该培养基进行探索，从而简化了培养基筛选过程，加快了试验进度，保留了新鲜花粉的活力，保证了试验的可靠性。

　　3.3温度对茶树花粉贮藏的影响

　　花粉活力保持时间由基因型决定[19]，同时植物花粉小，贮藏的营养物质有限，而其呼吸作用又比较强烈。因此，花粉生活力会因高强度呼吸导致花粉养分消耗过度而降低[20]。而贮藏前对花粉进行干燥处理降低花粉含水量，贮藏时选取低温、低O2含量、避光等条件将使花粉细胞内部各种代谢活动减缓，在相同时间内即可减少花粉有机物质消耗，利于延长花粉的寿命[21]。已有研究证实温湿度对茶树花粉贮藏影响较大[4-7]，本研究探讨了4种温度下贮藏两种供试花粉的活力变化。

　　贮藏温度对两个茶树品种的花粉生活力保持具有显著影响，且品种间受贮藏温度的影响也存在差异。温度越低越有利于花粉活力的保持，室温条件下，花粉贮藏120d生活力即降低至50%以下，180d后即完全失活。4℃可应用于两种花粉的短期贮藏（60d内），贮藏60d时，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为65.60%、45.14%，这为解决茶树育种授粉时花期不遇提供了较为简单的解决方案。-70℃最适于茶树花粉的长期贮藏（180d）；贮藏180d后，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为71.12%、50.61%；而-20℃贮藏180d后，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为60.16%、46.88%，仍具有一定的杂交可行性，可用于杂交育种工作的开展。因此，可根据实际的贮藏条件和贮藏所需天数制定两种供试花粉的贮藏方案，巧妙安排，合理利用。由于时间限制，本研究仅进行了180d，展现了不同贮藏温度下两种供试花粉的活力变化趋势，可以满足当季杂交工作的开展，但仍有必要探讨贮藏360d时花粉活力的保持情况。此外，贮藏后的花粉能否完成受精作用尚需进一步试验探讨。

　　参考文献：

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