畜牧养殖论文猪USF1基因克隆与序列分析

所属栏目：畜牧科学论文
发布时间：2014-04-24 11:01:45  更新时间：2014-04-24 11:45:44

　　上游刺激因子1（Upstreamstimulatoryfactor1，USF1）是螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（HLH-LZIP）转录因子家族成员之一[1]，可以与USF2形成二聚体，并能识别DNA的E-box序列，调节基因转录[2]。人类USF1基因位于1q22-q23[3]，并广泛表达于机体的各个组织，调控糖和脂肪代谢基因的表达[4]，此外USF1基因还具有调节免疫反应和细胞周期的功能[5]。

　　摘要：研究克隆了猪USF1基因1382bp的cDNA序列（登录号：EF219407）和5516bp的DNA序列（登录号：EF625885）。序列分析发现猪USF1基因编码区序列与人、小鼠的同源性分别为99%和98%。基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。

　　关键词：猪,USF1基因,克隆,序列分析

　　研究发现USF1基因可以作为调节治疗人的胰岛素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候选基因[6-9]。本研究利用EST信息和测序的方法克隆了猪USF1基因并进行了序列分析，为进一步研究该基因对猪生长发育的调控机理具有重要的意义。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　采集4月龄大白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）的肌肉组织，用液氮速冻置于

　　-70℃中，利用TRizol法提取总RNA，反转录得到cDNA。利用DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，贮存于-20℃。

　　pMD-18Tvectorsystem、DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司；GelExtractionKit购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

　　1.2引物设计

　　以人的基因序列为探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列，筛选猪的同源性EST（标准：长度≥200bp，相似性≥80%），用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接，参照拼接的contig（重叠群）采用Primer5.0软件设计引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6对引物（表1）扩增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

　　1.3PCR扩增与测序

　　PCR扩增体系为25μL，包括50ng模板DNA、2.5mmol/L1×TaqBuffer、1.5mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTPs、0.5mmol/LPCRprimers、2UTaqDNA聚合酶。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，退火（温度、时间根据引物来确定），72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用GelExtractionKit试剂盒纯化回收，与pMD-18Tvectorsystem连接，并转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。

　　2结果与分析

　　2.1RT-PCR扩增USF1基因

　　以大白猪cDNA为模版，利用引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R均扩增出了特异带，RT-PCR扩增产物结果如图1所示。将PCR产物回收、纯化、克隆测序，测序结果显示引物U1F/U1R扩增产物长度为613bp（图1a），引物U2F/U2R扩增产物长度为312bp（图1b），引物U3F/U3R扩增产物长度为520bp（图1c）。

　　2.2猪USF1基因的cDNA序列同源性分析

　　利用DNAStar软件的SeqMan程序将RT-PCR扩增得到的片段进行拼接，得到一条长1382bp的cDNA序列。将获得的猪USF1基因的cDNA序列分别与人USF1基因cDNA序列（NM_007122）和小鼠序列（NM_009480）进行比对。结果表明，猪与人、小鼠的同源性分别为99%和98%，确定所获取的序列为猪的USF1基因，提交到GenBank，得到登录号为EF219407。

　　2.3猪USF1与部分物种USF1的进化关系

　　利用GenBank已有的USF1蛋白质序列：NP_001001161（USF1，Cattle），NP_001007486（USF1，Gallus），NP_009053（USF1，Human），NP_033506（USF1，Mouse），NP_113965（USF1，Rat）以及猪USF1基因编码的氨基酸序列，利用ClustalW软件对6个物种的USF1氨基酸序列进行了序列比对，结果发现猪与人和牛的同源性达到了99%，与小鼠和大鼠的同源性达到了98%，并构建了系统进化树（图2）。

　　2.4猪USF1基因组序列的克隆和序列分析

　　根据人的cDNA序列和人的基因组序列比对结果，预测的猪USF1基因内含子，参照分离得到的基因序列，设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R和U9F/U9R等6对引物，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增猪USF1基因的10个内含子序列，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图3。

　　引物U4F/U4R在猪基因组中的扩增片段长度是2094bp，其中第1内含子的长度为2007bp；引物U5F/U5R在猪基因组中的扩增片段长度740bp，其中第2，3内含子的长度分别为363bp和157bp；引物U6F/U6R在猪基因组中的扩增片段长度783bp，其中第4，5内含子的长度分别为301bp和241bp；引物U7F/U7R在猪基因组中的扩增片段长度600bp，其中第6，7内含子的长度分别为249bp和135bp；引物U8F/U8R在猪基因组中的扩增片段长度656bp，其中第8，9内含子的长度分别为153bp和249bp；引物U9F/U9R在猪基因组中的扩增片段长度690bp，其中第10内含子的长度为192bp。利用DNAStar软件的SeqMan程序将扩增得到的片段进行拼接，得到一条5516bp的DNA序列，将序列拼接提交到GenBank收录号为EF625885。基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式都符合“GT-AG”法则。3小结与讨论

　　本研究中猪USF1基因的cDNA序列与人和小鼠的同源性分别为99%和98%；编码区的高度保守性证实了所分离基因的正确性，同时也为利用小鼠等模式动物的基因信息来进行畜禽基因组学的研究提供依据。

　　脊椎动物间的基因序列具有高度的保守性，根据已知物种的基因组序列，可以预测其他物种同源基因的基因序列。本研究利用人USF1基因序列，预测了猪USF1基因序列，并通过试验获得了相应的基因组序列。测序结果表明，所获得的候选基因的内含子和外显子组成及相对位置与预测结果一致，且内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。