红曲桔霉素及其检测方法研究进展

　　摘要：红曲霉能代谢生成天然红色素和多种生理活性物质而备受人们关注，但同时也发现其生长过程产生桔霉素。桔霉素是一种真菌毒素，具有肾脏毒性，可以引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。红曲霉中桔霉素的发现使得我国的红曲产品的安全性引起争议。本文对红曲霉中桔霉素的产生、理化特性和检测方法等内容进行综述。

　　关键词：桔霉素，红曲霉

　　红曲作为一种微生物发酵食品，在中国及其他亚洲国家已有数百年的应用历史。将红曲提取色素添加于肉制品、鱼制品、豆制品等各种食品中的主要目的，是赋予产品美观的色泽，如中国的叉烧肉、烧烤肉、酱卤肉、肉丸、各式灌肠或腊肠等。日本、印尼等国的一些肉制品中也应用了红曲色素，应用的主要目的是红曲色素的添加使产品呈现美观、均质、持久的红色泽，同时也作为调味料和防腐料，在一定程度上可提鲜增香和抑菌防腐。在中国传统医学上就将其作为防病保健食品，具有特殊的药理及营养功效，近代对其研究的深入，使得一些以红曲米为原料制备的中药制剂问世，例如作为降胆固醇、降血脂、降高血压、抗菌消炎、抗肿瘤等药剂。在特别看重“纯天然”食品的欧洲，作为天然添加剂的红曲色素早已引起广泛关注。

　　从1998年开始，由于欧洲科学家发现红曲中存在着一种名为桔霉素的物质对人体有潜在危害，使我国红曲出口受到严重威胁。目前，德国及欧美各国已在制订针对我国出口的红曲及相关产品的新标准，严格限制红曲及相关产品中桔霉素的含量，必须低于规定值，否则将禁止进口及销售。而目前我国的红曲及其相关产品中桔霉素含量很难达到控制标准，桔霉素问题成为限制我国红曲及相关产品出口的瓶颈问题。在这种情况下，如何减少红曲中的桔霉素含量是一个迫切需要解决的问题。本文综述了红曲中桔霉素的产生、理化特性和检测方法，并提出了控制桔霉素的具体措施。

　　1桔霉素的产生

　　1.1桔霉素的各种产生菌

　　桔霉素(citrinin)是由真菌产生的次级代谢产物。自然界中许多青霉和曲霉菌株能产生桔霉素，青霉中有纠缠青霉、瘦青霉、詹森青霉、黄绿青霉、扩展青霉、点青霉等;曲霉中有土曲霉、雪白曲霉、白曲霉、红曲霉等。产桔霉素的特征菌是桔青霉(Pencilliumcitrinium)。据报道，用查氏葡萄糖培养液30L接种桔青霉，培养两周后可提取桔霉素45~60g，产量高达1500~2000mg/L[1]。

　　1.2红曲霉中桔霉素的产生

　　对红曲霉及其代谢产物产生桔霉素的研究开始于90年代。1981年，香港中文大学的HinchungWang等人首次分离出红曲中的一种抑菌因子，命名为monascidinA。1993年，法国Blanc教授领导的研究小组用质谱、核磁共振和紫外及荧光分析等多种方法对monascidinA进行了结构测定，定性分析，发现monascidinA实质是桔霉素。此后，日本、美国、荷兰先后开展了研究[2]。

　　青霉和曲霉产桔霉素是经一个乙酰CoA分子和三个丙二酰CoA分子缩合成丁酮，然后进一步转化成桔霉素。而在红曲霉培养时，首先由一个乙酰CoA分子和四个丙二酰CoA分子缩合成戊酮，然后分经两条途径：一条途径是此戊酮再与丙二酰CoA分子缩合成己酮，最后生成红曲色素;另一途径是此戊酮经甲基化、缩合、还原、烷基化、还原、氧化、脱水等步骤，最后生成桔霉素[3]。如下图所示：

　　乙酰CoA+丙二酰CoA

　　聚酮酶

　　(B)四酮化合物(A)

　　五酮化合物

　　中间产物

　　桔霉素

　　CoASH

　　CO2

　　曲霉属或

　　青霉属

　　六酮化合物

　　红曲色素

　　(B)

　　图1红曲色素、桔霉素产生过程

　　2桔霉素的理化特性

　　从桔青霉(Penicilliumcitrinium)的蔡氏培养液中分离的桔霉素为柠檬一黄色针状棱形结晶，酸性。熔点：173~174℃。溶解性：纯桔霉素很难溶于水，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，微溶于乙醚。桔霉素的钠盐易溶于水。呈色反应：桔霉素与三氯化铁、溴、高锰酸钾反应呈阳性。溶于95%乙醇呈黄色，加过氧化氢后褪色，然后变浅褐，再加0.1mol/L硫酸变为橙黄色，再加0.2mol/L氢氧化钠又恢复酒红色[4]。桔霉素：(3R,4S)-4,6-二氢-8-羟基-3,4,5-三甲基-6-氧-3H-2-苯砒-7-羧酸，IUPAC：(3R，4S)-4，6-dihydro-8-hydroxy3，4，5-trimethyl-6-oxo-3H-2-benzopyran-7-carboxylicacid。桔霉素的2种异构体如下图：

　　图2桔霉素的2种异构体

　　3桔霉素毒性

　　桔霉素是一种真菌毒素(mycotoxin)，具有肾毒性，也称为肾毒素(nephrotoxin)，毒性比较明显，可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。经口喂，小鼠半致死量为110mg/kg[5]。在对小鼠的实验中，桔霉素减少了肾皮质和肝细胞中线粒体磷酸化的效率，显著抑制了肾皮质和肝细胞中2-酮戊二酸和丙酮酸脱氢酶的活性，使线粒体膜内外电位差减小，和呼吸链有关的几种酶系，苹果酸和谷氨酸的脱氢酶的活性受到抑制，桔霉素使线粒体基质中Ca2+的水平明显减少，影响膜转移和氧化还原系统。在对BHK-21细胞的实验中发现，桔霉素阻止了约45%的氧的消耗;约86%的葡萄糖不被利用。用与桔霉素结构类似物毛地黄普素处理的细胞，在ADP存在下以琥珀酸代谢供能时，其呼吸速率也被减少了约39%。用桔霉素处理过的细胞产生了很少的丙酮酸，但不能产生乳酸。桔霉素影响了呼吸链中能量的产生和糖酵解中乳酸的产生。在暴露于桔霉素l0h后，对细胞进行电镜检查，发现线粒体发生剧烈变化，肿大并引起细胞死亡[6]。

　　桔霉素同时有致畸性。据Ciegler等[4]的研究报告显示，在给发育4d的鸡胚胎注射桔霉素后，胚胎中的脚发生了变形。LD50值为80.5μg/egg，最大值131μg/egg，最小值54.3μg/egg。注射10μg/egg的致畸率为6%，50μg/egg的为46%，100μg/egg的为48%，150μg/egg的为73%。

　　4桔霉素的检测方法

　　4.1薄板层析法

　　薄板层析法是常用的定性和半定量确定红曲终得桔霉素含量的方法，方法灵敏简单，分为单项层析和双向层析。胡晓清等[8]利用水溶性色素和脂溶性色素在不同溶剂中溶解性的差异，以酸性水溶液为提取剂，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶3∶1)为展开剂，桔霉素的分离效果良好，排除了绝大部分色素的干扰。由于红曲中色素的含量很高，并且红曲的色素有6~8种之多，不同来源的红曲，其色素中红、橙、黄色素的量也不同。固态发酵得到的产物中还含有含量大量的其他代谢产物。所有这些都会对检测带来影响。用一般的薄层层析法分析红曲中的桔霉素，因干扰物太多，很难在板上分辨出来。因此宜采用双向薄层层析法。宫慧梅等[7]采用双向展开剂检测桔霉素利用双向薄层层析法可检测红曲中的桔霉素。这种方法可用于生产企业的自我监控方法简单易行，容易掌握所需的物品也不复杂，其最小检测量为0.1μg，是现阶段桔霉素检测的一种非常实用的方法。但不能进行定量分析，存在的干扰因素较多[8]。

　　4.2酶联免疫法

　　酶联免疫法是利用抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新方法。Abramson等利用传统抗血清完成对citrinin的酶联免疫法，但其精确度仍有待改善。因为Abramson生产的是传统多元性抗体，而红曲菌中有许多citrinin构型大小类似的分子可能会有相当的交叉反应，而造成误判[9、10]。陈富生等制备了牛血清白蛋白一一桔霉素包被抗原，用卵蛋白一一桔霉素连接物免疫小白鼠，得到抗血清，采用ELISA测定了小鼠抗血清效价，建立竞争ELISA检测红曲中桔霉素的方法[11，12]。

　　4.3高效液相色谱法

　　高压液相色谱法最精确，最近还发展了反相高效液相色谱法，配合荧光检测仪;采用冷冻干燥处理细胞，加入有机溶剂提取，所得结果比较精确灵敏。但是，样品的前处理仍然很麻烦，提取中桔霉素的损失也较多[13]。

　　红曲中化学成分非常多，目前鉴定出来的已有几十种，桔霉素仅是其中一种。要想通过高效液相色谱准确测定出红曲色素中桔霉素的含量，最重要的是要将桔霉素与红曲色素中其他成分分离开来，在实验中发现分离用的液相色谱柱对桔霉素的分离效果影响很大，用于分离测定红曲中桔霉素含量时，以瑞典产的Krorrnsi1Cl8分离效果最好。除色谱柱对分离效果影响较大外，选择合适的流动相将直接影响着桔霉素的分离效果。从操作简便且分离效果好等力一面综合考虑，通过比较不同的流动相，最后选定冰醋酸水溶液和甲醇(20%水醋酸水:甲醇==70:30)作流动相时获得了较理想的分离效果[14]。柴秋儿等[15]研究结果表明，ADS-5树脂可以纯化桔霉素，而且能好地减少色素的影响，经荧光检测器检测检出桔霉素含量最低检出限为0.2μg/L。该方法稳定可靠，为红曲产品的质量、安全使用及国际市场的开拓提供支持。

　　4.4抑菌圈法

　　抑菌圈法比较直接，利用红曲中所含桔霉素的抗菌性来间接定性和半定量。利用红曲中所含桔霉素的抗菌性来间接定性和半定量。根据经验，红曲中存在其他的抑菌物质，所以用此法检测红曲样品误差较大，并且不同的样品抑菌物质的含量都有变化[1]。

　　5结束语

　　红曲是我国传统发酵产品，毒理学实验已证明了红曲产品的食用安全性，并在长期的应用实践中未发现明显的毒副作用，但我国红曲的生产和应用行业都在密切关注桔霉素问题。近年来，我国红曲产品的出口已开始受到国际市场的压力，据悉，红曲产品已受到日本卫生部门的严格检验，认定为不含桔霉素才允许生产和出口，德国也明确提出今后若从中国进口红曲，必须有安全生产菌种及产品不含桔霉素的证明。红曲产品作为食品添加剂，应当不含桔霉素或尽可能少含桔霉素，所以可从以下几点考虑：首先应当筛选不产桔霉素或桔霉素生成量很低的菌种用于生产关于菌种问题。其次是通过发酵工艺的改良，减少桔霉素的生成关于培养基[13、16]。桔霉素因其携带一个酸性基团，所以需供氧率较色素高。因此可以通过调控培养过程中的通风和搅拌，控制桔霉素的合成[17]。因此，筛选低产或不产桔霉素的红曲霉菌种，对于我国红曲及其产品的生产和应用都将具有特别重要的意义。

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　　[16]许赣荣.红曲产品在欧洲的合法地位、菌种分类及有害物质桔霉素[J].酿酒科技，1998,6:16~18.

　　[17]HassanHajjaj.Medium-ChainFattyAcidsaffectCitrininproductionintheFilamentousFungusMOnascus[M].rubber.APPliedandEnvironmentalMicrobiology,2000,66:1120~1125.

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