林业工程师论文表盾叶薯蓣根状茎中皂苷的组织化学定位

　　摘要：应用植物解剖学、组织化学定位及植物化学技术，研究了盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)的解剖结构特征与皂苷积累的关系。结果表明，盾叶薯蓣根状茎主要由周皮、基本组织和散生的维管束构成。对盾叶薯蓣成熟根状茎的组织化学研究和对薯蓣皂苷元的含量测定结果一致，薯蓣皂苷主要存在于基本组织的薄壁细胞中，韧皮部的生活细胞和维管束鞘细胞有薯蓣皂苷的积累，粗壮的比纤细的根状茎中皂苷含量高，根状茎中段比两侧的皂苷含量高。

　　关键词：林业工程师论文表,盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis),根状茎,皂苷,组织化学,测定

　　Localization and Determination of Saponin in Rhizome of Dioscorea zingiberensis

　　ZAN Li-xia，XU Hao，ZHAO Hua，LI Hui-ning

　　(College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， Shaanxi， China)

　　Abstract： Anatomical， histochemical and phytochemical methods were used to investigate the structure， the localization and content changes of saponin in rhizome of Dioscoreae zingiberensis. Results showed that rhizome was composed of periderm， ground tissue and scattered vascular bundles. Diosgenin was mainly in the basic organization of parenchyma cells， and accumulated in living cells and bundle sheath cells of phloem. The diosgenin contents in the stout rhizomes was more than in the slender.

　　Key words： Dioscorea zingiberensis; rhizome; saponin; histochemistry; determination

　　盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)又名黄姜，是薯蓣科薯蓣属多年生草本植物。以根状茎入药，具有清肺止咳、利湿通淋、通络止痛、解毒消肿的功能，同时具有治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、降血脂等功效，也有降低胆固醇、抗炎、抗肿瘤等药理作用。其根茎中薯蓣皂苷元是合成甾体激素类药物和甾体避孕药的重要医药化工原料。

　　目前，对于盾叶薯蓣的研究大多集中在提取分离、解剖、胚胎、生理等方面[1-4]。肖冰梅等[5]、曹玉芳等[6]主要从形态发育解剖方面对盾叶薯蓣进行研究。本试验对盾叶薯蓣根状茎的解剖结构和皂苷元积累的关系进行研究，旨在为盾叶薯蓣药用植物的质量控制和快速检测提供理论和实践依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料、仪器和试剂

　　试验材料盾叶薯蓣于2012年采自安康市旬阳县刘家湾、宋家岭、郭家湾。

　　仪器：Nikon ECLIPSE E600型显微镜、Nikon SMZ800型解剖镜、YL3-A型�转式切片机(上海仪表厂)、1260型高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)、101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

　　试剂：FAA固定液(50%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=890∶50∶60)、1%番红染液、1%固绿染液、无水乙醇、二甲苯、1%酰胺黑、碘液、苏丹Ⅲ染色、5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂、氢氧化钠、碘-碘化钾、冰醋酸、明胶黏片剂、石蜡等，均为分析纯。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 形态解剖学方法选择生长健壮的盾叶薯蓣根状茎用FAA固定液固定，经乙醇系列脱水、透蜡、包埋、常规石蜡制片。切片厚度8～10 μm，黏片、脱蜡，用番红-固绿对染法染色，中性树胶封片，显微镜观察并照相。

　　1.2.2 皂苷的组织化学定位将新鲜材料用徒手切片，放置于载玻片上滴加等量的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂，对盾叶薯蓣的皂苷类物质进行组织化学定位[7]，显色后在Nikon ECLIPSE E600型显微镜下观察并照相。阴性对照采用FAA固定液浸泡1个月的材料同样方法制片观察。

　　1.2.3 贮藏物的组织化学定位[8]

　　1)常规石蜡切片，厚度8～10 μm，用1%酰胺黑染色，鉴定蛋白质;用碘液染色，鉴定淀粉。

　　2)采用5%氢氧化钠显色剂对盾叶薯蓣中的黄酮类物质进行组织化学定位。

　　3)根据生物碱与碘化铋钾(Dragendorff)和浓硝酸产生颜色反应的原理，用改良的碘化铋钾试剂(由0.85 g次硝酸铋溶于10 mL冰醋酸和40 mL去离子水后，再与20 mL 40%的碘化钾混合而成)处理5 min鉴定生物碱。

　　以上各处理用Nikon ECLIPSE E600型显微镜观察并照相。

　　1.2.4 盾叶薯蓣皂苷元含量的测定

　　1)对照品制备。精确称取盾叶薯蓣皂苷元对照品5.40 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度，摇匀，制成0.18 mg/mL的对照品储备液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，冰箱保存，备用。　　2)色谱条件。色谱柱：HiQsil C18柱(250 mm× 4.6 mm，10 μm)，流动相为甲醇-水(90∶10)(V∶V)，流速为0.8 mL/min，柱温为室温。

　　3)样品溶液的制备。取干燥盾叶薯蓣样品5.00 g，精确称量，置于250 mL圆底烧瓶中，加适量超纯水润湿，超声预处理20 min，加入2 mol/L硫酸溶液100 mL，在100 ℃水浴中水解4 h，冷却、过滤，残渣用去离子水洗至中性，收集残渣，60 ℃干燥，干燥后的粉末置于水浴中，40 ℃条件下用石油醚(沸程30～60 ℃)提取5 h，提取液挥发掉溶剂后真空干燥，得到盾叶薯蓣总皂苷元粗提取物，加甲醇使其溶解，定容至10 mL，摇匀，作为供试样品溶液。

　　4)标准曲线的绘制。分别吸取对照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，定容至10 mL，摇匀，得到5个不同浓度梯度的溶液。按上述色谱条件分别进样10 μL，进样时间20 min，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=5.364 4X+18.245，相关系数R2=0.998 8。

　　5)精密度试验。吸取上述对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算得到精密度RSD=1.41%。

　　6)重复性试验。取样品共6份，精确称重3.0 g，按上述方法测定样品中盾叶薯蓣皂苷元的平均含量(n=6)，计算得到RSD=1.22%。

　　7)稳定性试验。取样品按上述方法制备样品溶液，放置0、2、4、6、8、10 h，各精确进样10 μL，测定薯蓣皂苷元峰面积，计算得到RSD=1.24%。

　　2 结果与分析

　　2.1 盾叶薯蓣根状茎横切面的结构

　　盾叶薯蓣根状茎横切面的结构从外到内由周皮、基本组织和分散在基本组织中的维管束组成(图1a)。根状茎的保护组织由周皮及其外的残留表皮和薄壁组织构成。表面的5～6层细胞体积较大，略呈圆形，排列不整齐，外侧的细胞破碎(图1b)。这些细胞是周皮在基本组织内产生后，其外侧的表皮和薄壁组织的残留，其内的5～7层细胞排列整齐，呈长方形，体积小，属于周皮。其中外侧3～5层为木栓层细胞，细胞壁栓质化，其内为木栓形成层和栓内层细胞。根状茎的周皮以内是基本组织，维管束散生其中，因此其基本组织缺乏皮层、髓等划分。

　　在根状茎的基本组织的中部(8～10层细胞处)含有针晶的黏液细胞(图1c、d)，其针晶成束，长60～80 μm。黏液细胞常单独存在，少数相邻，在基本组织内排列成不连续的1圈。在上述外部区域的基本组织内，无维管束分布。其内为基本组织的内部区域，占根状茎横切面面积的90%左右，维管束散生在此部分基本组织内。此区域的基本组织都是薄壁组织细胞，其细胞体积较外区的略大，细胞也呈等径、近圆形，大小不一，内含物较多。

　　根状茎的维管束散生在内部区域的基本组织内(图1e、f)。此区域的边缘部分中，维管束较小，排列成不规则的两轮，其中外轮维管束数量较多，排列较紧密;内轮数量较少，排列较稀疏。中央部分内的维管束较大，其外侧的维管束排列成1轮，每个维管束都由1～2层维管束鞘包围着初生木质部和韧皮部构成。维管束鞘是由厚壁组织细胞组成。初生木质部在内侧，初生韧皮部在外侧，两者间有少数较大的薄壁细胞。后生木质部由10～16个大口径导管构成，有的中间被小口径导管分隔开，其内侧的导管较小，为原生木质部;后生韧皮部由筛管、伴胞和薄壁组织细胞构成，其外侧为少数原生韧皮部筛管，有的维管束内其筛管已被挤掉。小的维管束也由厚壁组织鞘包围，但其初生木质部和韧皮部细胞的数量较少。

　　2.2 盾叶薯蓣根状茎组织化学定位

　　盾叶薯蓣根状茎中总皂苷与5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂反应呈淡红和紫红色，阴性对照制片与皂苷显色剂不发生显色反应。

　　在盾叶薯蓣有维管束分布的基本组织内，组织细胞中薯蓣皂苷的积累与分布最丰富，细胞中的红色液滴数量多且密集。小型维管束分布部位的基本组织显色最明显，显示此处含皂苷量最高;在大型维管束分布的部位，基本组织中红色液滴相对较少。在基本组织薄壁细胞内侧，整个细胞呈浅红色，显色较均匀;韧皮部的筛管、伴胞和薄壁组织细胞以及维管束鞘细胞中都有薯蓣皂苷的积累和分布。木质部细胞和韧皮部的韧皮纤维中无显色反应;在木栓层及其残留并栓化的表皮和薄壁组织构成的保护组织的细胞内也无显色反应。

　　对储藏物组织化学研究发现，通过碘液染色，淀粉主要存在于薄壁组织的整个细胞中，含量较多，被染成蓝色;用1%酰胺黑染色，发现蛋白质被染成蓝色，蛋白质主要分布在薄壁细胞内壁上，且含量较少。而通过用碘液对淀粉的染色发现蛋白质呈黄色，主要存在于薄壁组织细胞壁及筛管中。

　　生物碱与碘-碘化钾试剂反应显棕色或者棕褐色，在基本组织内，外部没有维管束分布的部分，整个细胞显浅棕色，显色较均匀。而周皮部分的细胞显棕色，周皮内的15～18层细胞为薄壁组织细胞没有显棕色，在含有维管束部分的细胞中，维管束显棕褐色，其周围的薄壁组织不显棕色，因此推断，生物碱主要存在于周皮及维管束中。黄酮能与5%氢氧化钠反应显黄色，参照盾叶薯蓣的解剖结构对盾叶薯蓣根状茎中的黄酮进行组织化学定位，经观察，未发现黄色，表明不存在黄酮。

　　3 讨论

　　盾叶薯蓣根状茎中含有多种结构相似的皂苷成分，水解后成为薯蓣皂苷元。由于皂苷类成分通常分布于薄壁组织细胞中，不同药材皂苷的分布由于结构及发育时期的差异存在一定区别。组化研究中根据特定的显色剂能与薯蓣皂苷发生作用，生成大分子复合物显示出特定的颜色反应，并且颜色的深浅与薯蓣皂苷的含量呈正相关。本试验对盾叶薯蓣成熟根状茎的组织化学研究和对薯蓣皂苷元的含量测定结果一致，表明皂苷主要存在于分化完成的维管束周围基本组织内部，粗壮的比纤细的根状茎中皂苷含量高，根状茎中段比两侧的皂苷含量高。

　　参考文献：

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