中国农业科学范文钒抗性微生物的筛选

　　《中国农业科学》为综合性农牧业科学学术刊物。主要发表我国农牧业科学在基础理论和应用技术方面的学术论文、重要科研成果和专题报告及各学科研究进展综述等。主要栏目有作物栽培的理论与实践、作物育种与品种资源、生物技术、植保、土肥、畜牧、兽医、研究简报等。本刊读者对象为农牧业科技工作者、农业院校师生和农业管理干部。
　　摘要：试验从四川省攀枝花市朱家包包钒钛磁铁矿区的表层土壤中筛选出21株钒抗性微生物，经16S rRNA基因测序鉴定可知，筛选所得的微生物分别属于放线菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲。这些菌株的获得将为钒污染地区微生物资源的开发利用及矿区生态修复提供理论和技术支持。

　　关键词：钒,抗性微生物,筛选

　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.011

　　Abstract： 21 strains of microorganisms with vanadium-resistance were screened from the surface soil at ZhuJiaBaoBao V-Ti-bearing magnetite， Panzhihua. The results of sequencing 16S rRNA gene showed that these bacterial strains were belonged to Actinobacteridae， α-proteobacteria， β-proteobacteria and γ-proteobacteria， respectively. It will provide a theoretical and experimental supports for future exploitation of microbial resource in vanadium-polluted area and bioremediation of the vanadium mine area.

　　Key words： vanadium; metal-resistant microorganism; screening

　　钒钛磁铁矿是含有铁、钒、钛、铬等多种重金属的共生矿，有很高的综合利用价值。中国67.56%的钒资源来自钒钛磁铁矿[1]。钒的冶炼和钒合金的冶炼是环境中钒污染的重要来源。钒作为人体必需的微量元素具有多方面的生理作用，然而钒同时具有多方面的毒性和危害性。据文献报道金属钒毒性很低，但钒化合物对人及动物有中度或高度毒性[2]。其毒性作用与钒的价态、溶解度、摄取的途径等有关，价态越高，毒性越大[3]。除明显的急性中毒外，钒对人体尚有生殖毒性、胚胎毒性，可能还有致突变、致畸、致癌等毒性[4，5]。

　　基于微生物对重金属的积累和解毒作用，近年来以净化有毒金属污染为目的的生物修复技术正在兴起。微生物修复技术因其处理费用低、效率高、对环境影响小等优点，越来越受到广泛的关注[6-9]。

　　在过去的几十年里，国内外一些研究机构已在钒的生物效应及其环境地球化学行为等方面开展了大量研究工作，取得了一系列的成果[10-12]。这些研究成果是确定钒的环境行为，客观评价钒的生物可利用性和毒理性不可缺少的基础数据，也为人们有效地控制钒污染提供了科学依据。但有关钒污染生物修复方面的报道并不多见。

　　四川省攀枝花市朱家包包钒钛磁铁矿区位于攀枝花兰家火山矿区东部，在该矿开采期间，产生大量粉尘、废水和废渣，这些废弃物中含有大量的钒，通过扬尘、雨水冲刷等途径扩散到周围环境中，致使与该矿毗邻的水资源、农田土壤受到严重的重金属污染。为此，希望通过筛选一批重金属钒的抗性细菌，为矿区钒污染的生态修复提供菌种储备。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 样品采集

　　试验土样采自四川省攀枝花朱家包包钒钛磁铁矿区，采集表层(0～20 cm)土壤。土壤pH 8.03，土壤有机质含量为2.52±0.04 g/kg。土壤中V、Cr、Pb、Ni、Zn全量采用HF-HNO3-HClO4消煮，原子吸收法 (PerkinElmer AAS800，美国)进行测定[13](表1)。

　　1.1.2 土样的预处理土样置于无菌条件下的超净工作台中，经过滤后的空气风干，过筛。用于筛菌的土样过10目筛后装于采样瓶中，4 ℃下保存备用。采样瓶和筛子需用紫外进行灭菌预处理。

　　1.1.3 培养基和试剂无机盐液态培养基(1 L)：硫酸钠 2 g，磷酸氢二钾 6 g，磷酸二氢钾 5.5 g，氯化钾 2 g，七水合硫酸镁 0.2 g，微量元素 1 mL。

　　无机盐琼脂培养基：硫酸钠 2 g，磷酸氢二钾 6 g，磷酸二氢钾 5.5 g，氯化钾 2 g，七水合硫酸镁 0.2 g，微量元素 1 mL，琼脂 2.5 g，蒸馏水 200 mL。

　　有机培养基：蛋白胨 2 g，牛肉膏 1 g，氯化钠 2 g，琼脂 2.5 g，蒸馏水 200 mL。

　　微量元素配方(1 L)：二水合乙二胺四乙酸二钠 55.0 g，七水合硫酸锌 3.93 g，氯化钙 5.5 g，一水合硫酸锰 4.32 g，七水合硫酸亚铁 5.0 g，四水合钼酸铵 1.1 g，五水合硫酸铜 1.57 g，六水合氯化钴 1.61 g， pH 7.0。

　　重金属钒的加入，分别用浓度为1 000 mg/L的硫酸氧钒和偏钒酸钠标准溶液稀释得到所需浓度。

　　1.2 方法

　　1.2.1 菌种的分离纯化分别称取1 g土样加入到100 mL的含重金属钒浓度分别为10、30、60、100、200 mg/L的无机盐培养基中，对抗性菌种进行驯化。于28 ℃条件下，将混有土样的无机盐液体培养基置于摇床上培养，转速设定为150 r/min。培养14 d后，吸取5～10 mL原培养液转接到新的液体培养基中，继续恒温摇床培养14 d。

　　连续转接驯化4～5次，对驯化后的菌液进行稀释涂布，取10-3和10-4的稀释液各100 μL分别于含4价和5价重金属浓度为10、30、60、100、200 mg/L的无机盐培养平板上涂布培养，不同浓度梯度各做一组平行。　　采用同样的方法将菌液涂布于有机培养平板上进行培养。

　　培养一段时间后，根据出现菌落的形态特征做好标记，用接种环挑取单菌落，以划线法接种到新的培养平板中[14]，用封口膜封口，置于28 ℃恒温培养箱中培养。重复上述操作，直至获得纯培养。

　　1.2.2 DNA的提取试验采用加入蛋白酶K的方法使细菌细胞裂解。核酸抽提使用的是TIANGEN公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。按照说明书上的使用步骤进行操作。得到的DNA于4 ℃条件下保存。

　　1.2.3 钒抗性细菌的16s rRNA基因序列分析对供试菌体进行16s rRNA基因PCR扩增[15]。正向引物27F序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R序列为5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。 PCR反应体系(25 μL)：细菌基因组DNA模板 1 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，ExTaq聚合酶体系12.5 μL，去离子水 10.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，29个循环;72 ℃ 7 min。将PCR产物送于上海美吉生物医药科技有限公司测序。

　　将测序公司反馈回来的测序结果，运用DNAMAN软件将两端引物以外的序列去除，余下的序列提交到模式菌种库进行比对。将菌株序列及其相似度最高的模式菌种序列用DNAMAN软件构建系统发育树并进行16S rRNA基因同源性分析，发育树的构型和稳定性用DNAMAN软件取样分析1 000次，进行Bootstrap值分析和评价。

　　2 结果与分析

　　2.1 序列分析

　　从有机培养基中筛选出11株菌，其中9株属于变形菌门，2株属于放线菌门。其中，4价钒培养基中筛选到的菌株全部为变形菌门，而2株属于放线菌门的细菌均从5价钒培养基筛选得到(表2)。有机培养基中筛选出的优势菌大部分为伯克氏菌属。从无机培养基中筛选出10株菌，其中5株属于变形菌门，5株属于放线菌门，4价钒和5价钒培养基中筛选到的两类菌各占一半。而其中的IV4_2、IV5_4和IV5_5与模式菌的相似度达100%。所有这21株钒抗性细菌中，7株属于放线菌门，占全部菌株的33%;14株属于变形菌门，占全部菌株的67%，属于优势菌群。菌种的门类结构见图1。

　　郑晓丹等[16]从16株抗汞细菌中筛选得到1株有较强抗重金属镉能力的细菌，属于γ-变形菌纲气单孢菌目。盛下放等[17]从不同来源的土壤样品中筛选得到的2株镉抗性细菌分属于γ-变形菌纲假单孢菌目和芽孢杆菌纲芽孢杆菌目。耿印印等[18]从镉含量超标的土壤中分离得到的14株镉抗性细菌中，变形菌占总数的85.7%，属于优势菌群。卞光凯等[19]从江苏南通沿海滩涂耐盐植物的内生细菌中筛选得到的23株重金属抗性细菌分别属于变形菌门和厚壁菌门。由此可见，重金属抗性微生物在群落结构上有其相似的地方，可以作为后续研究的重点方向。

　　2.2 系统发育树分析

　　系统发育树分析表明，钒抗性菌可分为4个类群：放线菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲。其中，IV4_2、IV5_4和IV5_5的亲缘关系较近，均与模式菌Pimelobacter simplex(KCTC 9106)处在同一分支下，都属于放线菌纲。而IV4_3、IV5_3、OV5_6和OV5_7也属于放线菌纲。IV5_1和IV5_2的亲缘关系较近，均与模式菌Methylopila capsulate IM1处在同一分支下，都属于α-变形菌纲。而IV4_1、IV4_4和IV5_6也属于α-变形菌纲。OV4_2、OV4_3、OV4_4、OV5_2、OV5_3、OV5_4和V5_5的亲缘关系较近，均与模式菌Burkholderia fungorum (LMG 16225)处在同一分支下，都属于β-变形菌纲。而OV4_1和OV5_1的亲缘关系较近，均与模式菌Pseudomonas otitidis (MCC10330)处在同一分支下，都属于γ-变形菌纲(图2)。

　　3 小结与讨论

　　微生物作为人类最宝贵、最具开发潜力的资源宝库，种类繁多、分布广泛，具有繁殖迅速、个体微小、比表面积大、对环境适应能力强等特点。在受重金属污染的生态环境中，微生物产生各种变化以适应重金属的胁迫。筛选耐重金属细菌的一般途径是在培养基中加入特定的金属，再逐步提高该重金属浓度的驯化条件下，经多代传种而获得目的菌株。

　　本研究从攀枝花市朱家包包钒钛磁铁矿区边坡的土壤样品中筛选到21株细菌。经试验证实，从含低浓度重金属钒的培养基平板中筛选出来的细菌都可以在200 mg/L钒离子浓度条件下生长，表明这21株细菌均可以耐受较高浓度的重金属钒。

　　参考文献：

　　[1] 滕彦国，徐争启，王金生，等.钒的环境生物地球化学[M].北京：科学出版社，2011.

　　[2] 王夔.生命科学中的微量元素[M].北京：中国计量出版社，1996.

　　[3] 国洁成.人体必需微量元素钒的生理功能[J].护士进修杂志，1991，6(2)：9.

　　[4] JOE J，HARRISION， HOWARD C，et al. Multimetal resistance and tolerance in microbial biofilms[J]. Nature Reviews Microbiology， 2007， 12(5)： 928-938.

　　[5] 文香兰，沈桂月，文永植.钒毒性的研究进展[J].广东微量元素科学，1997，4(10)：9-11.

　　[6] 周启星，宋玉芳.污染土壤修复原理与方法[M].北京：科学出版社，2004. 　　[7] 王旭，张豪，张松林，等.土壤重金属污染及修复技术的研究进展[J].甘肃农业，2011(3)：60-62.

　　[8] 刘玉燕，刘敏，刘浩峰.城市土壤重金属污染特征分析[J].土壤通报，2006，37(1)：184-188.

　　[9] 罗强，任永波，郑传刚.土壤重金属污染及防治措施[J].世界科技研究与发展，2004，26(2)：42-46.