辽宁工程技术大学学报农业论文范文赏析

　　本文是一篇农业工程类论文范文，论述了响应面法对漆斑菌液体发酵产胆红素氧化酶条件的优化，选自期刊辽宁工程技术大学学报（自然科学版），本刊的前身是《阜新矿业学院学报》是辽宁省教育厅主管辽宁工程技术大学主办，辽宁工程技术大学学报编辑部编辑出版的综合性学术刊物。读者对象为全国有关高校、科研单位、厂矿企业及管理部门的科研人员、工程技术人员研究生等。
　　摘要：对漆斑菌(Myrothecium sp. IMER1)菌株液体发酵产胆红素氧化酶的条件进行了优化。采用单因素试验筛选出最适碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵，pH为7，温度为28 ℃和最有效促进产酶的金属离子为Cu2+。在此基础上，利用Plackett-Burman 设计对影响产酶因素的效应进行评价，筛选出具有显著影响的3个因素葡萄糖、pH和温度。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，得出pH、温度和葡萄糖分别为5.7、28 ℃、8 g/L时，优化后液体发酵液中胆红素氧化酶活力提高到0.627 U/mL，比未优化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍，结果表明单因素与响应面结合法可优化菌株IMER1液体发酵产胆红素氧化酶的条件。

　　关键词：胆红素氧化酶,漆斑菌(Myrothecium sp. IMER1),Plackett-Burman设计,响应面法

　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.031

　　Abstract：The fermentation conditions of producing bilirubin oxidase (BOX) by Myrothecium sp. IMER1 were optimized. The optimal carbon source glucose， nitrogen source NH4NO3， pH 7， 28 ℃ and metal ion Cu2+ were screened with single factorial experiments. Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six factors related to BOX production. Three statistically significant factors including glucose， pH and temperature were selected. The path of steepest ascent was used to approach the optimal region of BOX production subsequently. The optimal combined concentration for maximum enzyme activity was further optimized by response surface methodology and determined as follows： 5.7，28 ℃， 8 g/L. The maximum enzyme activity was 0.627 U/mL. The optimization of culture conditions of IMER1 led to about 2 fold increase in BOX enzyme activity compared with initial result 0.214 U/mL， indicating that single factor in combination with response surface methodology was an effective method for optimizing BOX enzyme activity conditions by Myrothecium sp. IMER1.

　　Key words： bilirubin oxidase; Myrothecium sp. IMER1; Plackett-Burman design; response surface methodology

　　漆斑菌属(Myrothecium)是一种无性型丝状真菌，属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目瘤座孢科(Tuberculariaceae)。漆斑菌属是产胆红素氧化酶的主要真菌，工业上常用该属菌株生产胆红素氧化酶(Bilirubin oxidase， BOX)[1]。胆红素氧化酶是一种含铜的多酚氧化酶，能催化胆红素氧化，氧气是其电子受体。反应过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素，后者可进一步氧化最终生成无色化合物[2-4]。在临床检验中，常使用胆红素氧化酶来测定血液中胆红素的含量。相比较其他胆红素测定方法，酶学方法具有特异性、灵敏度高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测[5，6]。近年来，由于胆红素氧化酶的底物范围广和氧化能力强，目前已被用于生物电池的制造、污水处理等方面的研究[7-11]。

　　响应面法是利用合理的试验设计并通过试验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。该方法在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中实际问题的一种有效方法，已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域[12]。为了提高漆斑菌产BOX的能力，使其产酶量达到工业生产规模的需求，本试验对漆斑菌菌株Myrothecium sp.IMER1在液体培养体系中发酵产酶的影响因子进行了研究和优化。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　供试漆斑菌IMER1，从武汉植物园土壤中分离得到;2，2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸铵)(ABTS)，美国SIGMA公司;马铃薯液体培养基(PDB)：20%马铃薯(削片煮水)+2%葡萄糖。

　　紫外可见分光光度仪(UNICO-UV-2000型)，上海尤尼柯仪器有限公司;台式高速冷冻离心机(TGL-16/TGL16型)，湖南湘仪集团;全温气浴振荡摇床(ZD-88型)，金坛市成辉仪器厂。　　1)回归模型的建立及置信度分析。以BOX酶活为响应值，根据表5的试验结果，用SAS统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表6、表7。从方差分析中可以看出，各试验因素响应值的影响不是简单的线性关系。根据试验因素对响应值的影响，拟合得到多项式回归模型为：Y1=0.642 963+0.014 722×pH+0.004 44×Glu-0.153 056×T-0.099 537×pH×pH+0.058 889×pH×Glu-0.005×pH×T-0.067 87×Glu×Glu+0.098 889×Glu×T-0.076 204×T×T。

　　从表6中可以看出，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系是显著的，决定系数为98.71%，说明回归方程的拟合程度很好。

　　2)显著因素水平的优化和验证。运用SAS软件对回归模型进行规范性分析，寻求最大酶活量的稳定点及对应的因素水平，结合图6的回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点，对应的pH、T、Glu实际取值分别为5.7、28 ℃、8 g/L，BOX酶活的最大估计值为0.643 U/mL。在以上优化条件下进行验证试验，共进行3次100 mL的摇瓶试验，BOX酶活分别为0.582、0.639、0.662 U/mL，平均值为0.627 U/mL。证明预测值0.643 U/mL与试验平均值0.627 U/mL非常接近，同时比没有优化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍。

　　3 小结

　　漆斑菌属是产BOX的主要真菌，有关其产酶条件的优化报道不多。多数微生物产酶条件优化采用单因素试验、正交试验及响应面试验分析，这些方法存在一定的缺陷[14]。本试验通过整合单因素试验和Plackett-Burman设计，结合最陡爬坡路径试验和响应面中心组合设计，对菌株Myrothecium sp.IMER1在液体培养体系中高效产胆红素氧化酶条件进行了优化，获得了比较理想的结果。菌株IMER1以PDB培养基为基础，在外加碳源和氮源中，葡萄糖、蔗糖和硝酸铵能提高BOX产量;在中性偏碱性的pH 7～9范围内，BOX产量要比在酸性条件下高，其最适产酶pH为7;最适产酶温度为28 ℃;在培养基中加入Cu2+对产BOX有明显的促进作用。运用响应面法优化液体体系产BOX酶的条件，结果表明，在pH、温度、Cu2+、碳源和氮源等影响因素中，pH、温度和碳源属于主效因子。当pH、温度和葡萄糖分别为5.7、28 ℃、8 g/L时，酶活力可达到最大优化值，比没有优化前的酶活力量提高近2倍。

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